洋金花治療銀屑病有效部位的化學(xué)成分及作用機(jī)理研究.pdf

1、洋金花為茄科植物白曼陀羅DaturametelL.的干燥花，又名曼陀羅花、風(fēng)茄花、山茄子、大顛茄和白花曼陀羅等。洋金花生理活性較強(qiáng)，藥用歷史悠久，應(yīng)用十分廣泛。《中國(guó)藥典》2005版記載其性味辛、溫，有小毒；具平喘止咳、鎮(zhèn)痛解痙、麻醉之功效。近年來臨床應(yīng)用洋金花制劑治療銀屑病取得了顯著的治療效果，為了深入闡明洋金花治療銀屑病的有效成分及其作用方式和作用機(jī)制，本文進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。 本文經(jīng)過長(zhǎng)期反復(fù)的摸索，最終采用葡聚糖凝膠(Se

2、phadexLH-20)柱色譜以水-甲醇溶劑系統(tǒng)成功地對(duì)洋金花治療銀屑病的有效部位進(jìn)行了分離。從洋金花治療銀屑病有效部位中得到洋金花醉茄甾內(nèi)酯類組分(以下簡(jiǎn)稱洋金花醉茄甾內(nèi)酯類組分)和洋金花黃酮類組分(以下簡(jiǎn)稱洋金花黃酮類組分)，其中洋金花黃酮類組分占有效部位總量的53％以上。 通過硅膠、ODS、SephadexLH-20等柱色譜和HPLC等手段，從洋金花醉茄甾內(nèi)酯類組分和洋金花黃酮類組分中分離出10種單體化合物，采用UV、IR

3、、1H-NMR、13C-NMR、1H-1HCOSY、HSQC、HMBC和NOESY等1D及2D-NMR波譜學(xué)測(cè)試技術(shù)，并結(jié)合ESI-MS、FAB-MS等質(zhì)譜技術(shù)對(duì)分離獲得的10種單體化合物進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒(確)定，其中有2種黃酮類化合物和8種醉茄甾內(nèi)酯類化合物，它們分別被命名為山柰酚3-O-β-D-葡萄吡喃糖基(1→2)-β-D-葡萄吡喃糖基-7-O-α-L-鼠李吡喃糖苷(Kaempferol3-O-β-D-glucopyranosyl(1

4、→2)-β-D-glucopyranosyl-7-O-α-L-rhamnopyranoside)；山柰酚3-O-α-L-鼠李吡喃糖基(1→6)-β-D-葡萄吡喃糖基-7-O-β-D-葡萄吡喃糖苷(Kaempferol3-O-α-L-rhamnopyranosyl(1→6)-β-D-glucopyranosyl-7-O-β-D-glucopyranoside)；洋金花苷B(DaturametelosideB)；洋金花苷C(Daturame

5、telosideC)；WithametelinC；洋金花苷F(DaturametelosideF)；洋金花苷I(DaturametelosideI)；洋金花素K(DaturametelineK)；洋金花素L(DaturametelineL)；洋金花素M(DaturametelineM)。在這10種化合物中，確定有3種醉茄甾內(nèi)酯類化合物為新化合物，分別是洋金花素K(DaturametelineK)；洋金花素L(Daturameteline

6、L)；洋金花素M(DaturametelineM)。 為了深入研究洋金花治療銀屑病有效成分的種類和數(shù)目，本文采用3種與銀屑病相關(guān)的體外模型對(duì)洋金花有效部位、洋金花醉茄甾內(nèi)酯類組分、洋金花黃酮類組分以及洋金花苷B和洋金花苷C進(jìn)行了探討。 在DMSO誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞活性降低模型中，應(yīng)用噻唑藍(lán)(MTT)法和乳酸脫氫酶(LDH)活性測(cè)定法觀察洋金花有效部位及其組分對(duì)DMSO損傷HaCaT細(xì)胞的活性變化情況。結(jié)果表明，20-80

7、μg/mL洋金花有效部位呈劑量依賴性地增加細(xì)胞活性；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，洋金花醉茄甾內(nèi)酯類組分(30-240μg/mL)對(duì)DMSO的細(xì)胞損傷作用無明顯影響，而洋金花黃酮類組分在5-20μg/mL的濃度內(nèi)呈劑量依賴性地保護(hù)DMSO對(duì)HaCaT細(xì)胞的損傷作用。對(duì)DMSO損傷人永生化表皮角質(zhì)形成細(xì)胞具有保護(hù)作用的可能是洋金花有效部位及其黃酮類組分。 在IFN-γ誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞凋亡模型中，應(yīng)用噻唑藍(lán)(MTT)法和乳酸脫氫酶(LDH)活性

8、測(cè)定法觀察洋金花有效部位及其組分對(duì)γ-干擾素誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞的活性改變情況；應(yīng)用Hoechst33342染色法和流式細(xì)胞儀(FCM)觀察洋金花有效部位及其組分對(duì)γ-干擾素誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞凋亡的影響；應(yīng)用蛋白質(zhì)免疫印跡(Westernblotting)方法檢測(cè)洋金花有效部位及其組分對(duì)銀屑病直接相關(guān)蛋白K17表達(dá)的影響。結(jié)果表明，25-50μg/mL洋金花有效部位對(duì)凋亡的HaCaT細(xì)胞有明顯保護(hù)作用，且呈劑量依賴性地增加細(xì)胞活性；進(jìn)一步

9、研究顯示醉茄甾內(nèi)酯類組分(21.5-86μg/mL)對(duì)IFN-γ的細(xì)胞凋亡作用無明顯影響，而黃酮類組分在5-10μg/mL的濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴性地增加細(xì)胞活性。應(yīng)用Hoechst33342染色，熒光顯微鏡觀察后可見到凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)濃染致密的顆?？鞝顭晒饣驘晒馑槠?5μg/mL洋金花有效部位和5μg/mL黃酮類組分可以明顯降低凋亡碎片的熒光強(qiáng)度，而醉茄甾內(nèi)酯類組分并不能有效地抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)后可以得到

10、同樣結(jié)果，再觀察HaCaT細(xì)胞細(xì)胞周期的變化，發(fā)現(xiàn)洋金花有效部位、醉茄甾內(nèi)酯類組分和黃酮類組分均沒有改變凋亡細(xì)胞的細(xì)胞周期。應(yīng)用Westernblotting檢測(cè)K17蛋白的表達(dá)，結(jié)果表明12.5-50μg/mL洋金花有效部位和2.5-10μg/mL黃酮類組分可有效的抑制IFN-γ刺激產(chǎn)生的K17基因的翻譯水平，使K17蛋白的表達(dá)量降低，而醉茄甾內(nèi)酯類組分在此模型中并無明顯藥理活性。洋金花有效部位和黃酮類組分在γ-干擾素誘導(dǎo)的HaCaT

11、凋亡模型中顯示出明顯的抗細(xì)胞凋亡的藥理活性，其作用機(jī)理可能與改善細(xì)胞的凋亡狀態(tài)和抑制K17蛋白的表達(dá)有關(guān)。 在EGF誘導(dǎo)人永生化表皮角質(zhì)形成細(xì)胞增殖的模型中，應(yīng)用噻唑藍(lán)(MTT)法和乳酸脫氫酶(LDH)活性測(cè)定法觀察洋金花有效部位及其組分、洋金花苷B和洋金花苷C對(duì)EGF誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞的活性改變情況；應(yīng)用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察洋金花醉茄甾內(nèi)酯類組分、洋金花苷B和洋金花苷C對(duì)EGF誘導(dǎo)產(chǎn)生的K17蛋白熒光強(qiáng)度的影響；同時(shí)應(yīng)用激

12、光掃描共聚焦顯微鏡還觀察了醉茄甾內(nèi)酯類組分、洋金花苷B和洋金花苷C對(duì)增殖細(xì)胞胞漿內(nèi)[Ca2+]i的影響。結(jié)果表明，洋金花醉茄甾內(nèi)酯類組分(43-86μg/mL)、洋金花苷B(3-30μg/mL)和洋金花苷C(3-30μg/mL)均可以劑量依賴性地降低HaCaT細(xì)胞的活性；進(jìn)一步研究得知洋金花有效部位(12.5-50μg/mL)和黃酮類組分(2.5-10μg/mL)對(duì)增殖的HaCaT細(xì)胞無明顯抑制作用。應(yīng)用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察，EGF

13、可以使K17蛋白的熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，醉茄甾內(nèi)酯類組分、洋金花苷B和洋金花苷C均可以使增強(qiáng)的K17蛋白熒光強(qiáng)度下降，而洋金花有效部位和黃酮類組分并不能改變K17的熒光強(qiáng)度；應(yīng)用激光掃描共聚焦顯微鏡在0-20h各個(gè)時(shí)間點(diǎn)觀察增殖細(xì)胞胞漿內(nèi)[Ca2+]i的變化，結(jié)果顯示醉茄甾內(nèi)酯類組分、洋金花苷B和洋金花苷C在作用于HaCaT細(xì)胞16-20h后可以明顯降低[Ca2+]i。醉茄甾內(nèi)酯類組分、洋金花苷B和洋金花苷C在表皮生長(zhǎng)因子(EGF)誘導(dǎo)人永

14、生化表皮角質(zhì)形成細(xì)胞增殖的模型中顯示出很好的抑制作用，其作用機(jī)理可能與抑制K17蛋白的表達(dá)和降低細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i有關(guān)。 綜上所述，洋金花治療銀屑病有效部位主要包括黃酮類組分和醉茄甾內(nèi)酯類組分。在銀屑病相關(guān)的細(xì)胞模型上，發(fā)現(xiàn)黃酮類組分對(duì)DMSO和INF-γ所致細(xì)胞損傷和凋亡具有明顯的細(xì)胞保護(hù)作用，而醉茄甾內(nèi)酯類組分，洋金花苷B以及洋金花苷C對(duì)EGF誘導(dǎo)細(xì)胞過度增殖顯示出明顯的抑制作用。對(duì)HaCaT細(xì)胞具有凋亡誘導(dǎo)作用的INF-

15、γ和具有增殖促進(jìn)作用的EGF均可使HaCaT細(xì)胞K17過表達(dá)，而洋金花有效部位中的黃酮類組分和醉茄甾內(nèi)酯類組分對(duì)不同狀態(tài)下的HaCaT細(xì)胞K17的過表達(dá)分別具有明顯的抑制作用。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，洋金花治療銀屑病有效部位中的黃酮類組分和醉茄甾內(nèi)酯類組分對(duì)銀屑病相關(guān)的病理生理改變的干預(yù)作用并不完全相同，同一有效部位不同的有效組分對(duì)表皮角質(zhì)形成細(xì)胞消亡和增殖病理生理過程具有不同的藥理活性可能是洋金花有效部位治療銀屑病的特點(diǎn)之一，充分體現(xiàn)了中藥