新型Vip3A蛋白抗二化螟機(jī)理研究.pdf

1、營養(yǎng)期殺蟲蛋白(VIPs)是來自于蘇云金芽孢桿菌在營養(yǎng)生長對(duì)數(shù)中期開始分泌的一類胞外毒素蛋白，是與殺蟲晶體蛋白(ICPs)殺蟲作用機(jī)制截然不同的第二代新型殺蟲蛋白。目前已利用vip基因構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因水稻等多種轉(zhuǎn)基因作物，但尚未發(fā)現(xiàn)具有抗二化螟能力的vip基因的報(bào)道，在本實(shí)驗(yàn)室前期合作研究中發(fā)現(xiàn)一個(gè)具有抗二化螟能力的轉(zhuǎn)vip3A基因水稻，該基因暫定名為SBR(Stem Borer Resistance)。按照Vip3A蛋白結(jié)構(gòu)及前人研究報(bào)道

2、，將Vip3A蛋白序列分為1-199氨基酸的N-端，200-533氨基酸的核心區(qū)域和534-789氨基酸的C-端。SBR基因由兩個(gè)vip3A基因vip3Aa1和vip3Ad2的不同功能域嵌合形成，其蛋白組成包括Vip3Ad2-N端，Vip3Ad2核心區(qū)域和Vip3Aa1-C端。本研究利用vip3Aa1和vip3Ad2的不同功能域嵌合成三個(gè)不同的vip3A基因包括SBR、vip3AaAd1和vip3AaAd2基因，對(duì)5個(gè)vip3A基因(v

3、ip3Aa1、vip3Ad2、SBR、vip3AaAd1和vip3AaAd2)進(jìn)行抗蟲性鑒定分析；通過胰蛋白酶處理分析相應(yīng)蛋白對(duì)于胰蛋白酶的敏感性；再進(jìn)一步將上述5個(gè)vip3A基因兩端(N端和C端)分別同紅色熒光蛋白rfp基因和綠色熒光蛋白gfp基因從而獲得攜帶標(biāo)記蛋白的原核表達(dá)蛋白和含雙色基因的轉(zhuǎn)vip3A基因水稻，通過二化螟喂食實(shí)驗(yàn)，以期了解Vip3A蛋白在二化螟體內(nèi)結(jié)合部位和作用機(jī)理。其主要結(jié)果如下：
　　1、構(gòu)建5個(gè)vip

4、3A基因植物表達(dá)載體p1300-Vip3Aa1、p1300-Vip3Ad2、p1300-SBR、p1300-Vip3AaAd1和p1300-Vip3AaAd2，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得轉(zhuǎn)vip3A基因水稻；通過對(duì)T0代和T1代轉(zhuǎn)化體材料進(jìn)行二化螟抗性初步鑒定發(fā)現(xiàn)，vip3Aa1、SBR、vip3AaAd1和vip3AaAd2基因表現(xiàn)出高抗二化螟能力，而vip3Ad2基因只表現(xiàn)出一般的抗二化螟能力。由于Vip3Ad2的C末端比Vip3Aa1的

5、C末端少了3個(gè)氨基酸，推測(cè)SBR基因抗二化螟能力與來源于vip3Aa1基因的C端基因序列密切相關(guān)。
　　2、構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET28-Vip3Aa1，pET28-Vip3Ad2，pET28-SBR，pET28-Vip3AaAd1和pET28-Vip3AaAd2并誘導(dǎo)獲得相應(yīng)表達(dá)蛋白；通過不同濃度的胰蛋白酶處理5個(gè)Vip3A蛋白，發(fā)現(xiàn)胰蛋白酶濃度超過0.1μg/μL時(shí)才能消化產(chǎn)生62KDa核心多肽，當(dāng)胰蛋白酶濃度達(dá)1.0μg/μ

6、L， Vip3Ad2蛋白的62KDa核心多肽被消化降解，而Vip3Aa1、SBR、Vip3AaAd1和Vip3AaAd2蛋白的62KDa核心多肽未被消化降解，表明來源于vip3Aa1基因的C末端（534-789區(qū)域）對(duì)于62KDa毒性核心多肽的穩(wěn)定起到至關(guān)重要的作用，該結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了SBR基因抗二化螟能力與來源于vip3Aa1基因的C端基因序列密切相關(guān)。
　　3、構(gòu)建5個(gè)vip3A基因融合gfp和rfp基因的植物表達(dá)載體和原核表