高糖誘導(dǎo)人內(nèi)皮細(xì)胞PKC-δ信號(hào)通路中核蛋白效應(yīng)子的組學(xué)研究.pdf

1、背景與目的:在糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中,內(nèi)皮細(xì)胞穩(wěn)態(tài)失調(diào)被認(rèn)為是重要的始動(dòng)事件。既往研究表明,高糖可延緩細(xì)胞增殖,干擾細(xì)胞周期,誘發(fā)DNA損傷并可輕度加速細(xì)胞死亡,其詳細(xì)的分子機(jī)制尚未完全闡明。近年來(lái),大量研究提示,蛋白激酶C(PKC)的激活可能是糖尿病血管病變重要的發(fā)病機(jī)制之一,但目前尚缺乏針對(duì)PKC亞型信號(hào)機(jī)制特征的全景式描述。
　　 糖尿病動(dòng)物和體外研究均發(fā)現(xiàn),在眾多PKC亞型中,β和δ亞型在血管床被優(yōu)先激活。動(dòng)物

2、研究和臨床試驗(yàn)也表明,PKC-β的活化尚不能完全解釋糖尿病視網(wǎng)膜病變的病理特征,然而,目前對(duì)PKC-δ的認(rèn)識(shí)無(wú)明確結(jié)論。研究發(fā)現(xiàn),慢性高糖刺激細(xì)胞(如內(nèi)皮細(xì)胞、腎臟系膜細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞)增加二脂酰甘油合成從而誘導(dǎo)PKC-δ活化,并且新近研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),在視網(wǎng)膜周細(xì)胞中,高糖可通過(guò)PKC-δ誘導(dǎo)氧化應(yīng)激介導(dǎo)的NF-κB激活和血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGF)β受體信號(hào)失活這兩個(gè)關(guān)鍵途徑促進(jìn)細(xì)胞凋亡；在胎羊肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中可通過(guò)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶

3、(ERK)或Akt途徑調(diào)節(jié)一氧化氮生成及內(nèi)皮型一氧化氮合酶表達(dá)；在脂肪酸刺激的β細(xì)胞中則通過(guò)抑制叉頭蛋白O1(FOXO1)活性參與凋亡調(diào)節(jié)。以上不同環(huán)境下的PKC-δ作用表明,PKC-δ影響了細(xì)胞凋亡啟動(dòng)及終末環(huán)節(jié)的不同信號(hào)途徑。
　　 然而,以上的研究?jī)H僅關(guān)注某一已知信號(hào)通路,實(shí)際上,細(xì)胞信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)并不是點(diǎn)對(duì)點(diǎn)的線性關(guān)系,而是相互交聯(lián)的復(fù)雜模式。與以往的研究不同,我們發(fā)現(xiàn)高糖負(fù)荷人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)6天可誘導(dǎo)PKC

4、-δ核轉(zhuǎn)位,已知細(xì)胞核不僅含有基因信息,并且是基因表達(dá)的場(chǎng)所,因此,核蛋白的鑒別對(duì)于基因組的功能調(diào)節(jié)研究至關(guān)重要,并可為新蛋白的分子功能研究提供相關(guān)線索。另外,鑒于我們通過(guò)腺病毒載體轉(zhuǎn)染使PKC-δ持續(xù)激活,檢測(cè)到顯著的HUVEC凋亡及周期阻滯,由此假設(shè),PKC-δ作為上游調(diào)控元件,寡聚一系列下游效應(yīng)分子,從而啟動(dòng)了調(diào)控細(xì)胞行為的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件,因此,對(duì)此信號(hào)通路中重要分子的識(shí)別將進(jìn)一步深化對(duì)細(xì)胞凋亡及周期分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)。
　　

5、功能蛋白質(zhì)組學(xué)是一項(xiàng)細(xì)胞功能分子機(jī)制研究的新興技術(shù),是生理病理?xiàng)l件下蛋白量變的高通量研究的理想工具,在揭示未知蛋白和參與細(xì)胞結(jié)構(gòu)功能變化的鮮見蛋白研究上提供了新的方法。如今,蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已廣泛運(yùn)用于臨床與基礎(chǔ)研究,但糖尿病并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制中卻報(bào)道甚少,因此,采用蛋白質(zhì)組學(xué)研究高糖條件下PKC-δ促細(xì)胞凋亡信號(hào)通路的下游效應(yīng)子具有重要意義。
　　 方法:
　　 1.重組腺病毒的轉(zhuǎn)染及細(xì)胞分組
　　 構(gòu)建表達(dá)PKC

6、-δ的重組腺病毒載體Ad5-PKCδ并包裝,Ad5-Null作為空載體對(duì)照轉(zhuǎn)染HUVEC。共分5組處理細(xì)胞:正常葡萄糖對(duì)照組(NC,含5.6mmol/L D-葡萄糖),高糖組(HG,含25mmol/L D-葡萄糖),空載體對(duì)照組(EC,Ad5-Null轉(zhuǎn)染細(xì)胞后培養(yǎng)于25mmol/L的高糖培養(yǎng)基中),PKC-δ過(guò)表達(dá)組(PO,Ad5-PKCδ轉(zhuǎn)染細(xì)胞后培養(yǎng)于25mmol/L的高糖培養(yǎng)基中),PKC-δ抑制組(PI,Ad5-PKCδ轉(zhuǎn)染細(xì)

7、胞后培養(yǎng)于含10umol/L Rottlerin的高糖培養(yǎng)基中)。
　　 2.激光共聚焦檢測(cè)免疫熒光標(biāo)記PKC-δ
　　 生長(zhǎng)于爬片上的細(xì)胞先后用PKC-δ多克隆抗體及異氰酸熒光素標(biāo)記二抗孵育。激光共聚焦檢測(cè)PKC-δ熒光表達(dá)強(qiáng)度及分布。
　　 3.細(xì)胞周期及凋亡檢測(cè)
　　 細(xì)胞培養(yǎng)6天后,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布,并將各組細(xì)胞用Annexin-FITC標(biāo)記后采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。
　

8、　 4.雙向電泳及質(zhì)譜分析
　　 從以下四組細(xì)胞中提取核蛋白:正糖對(duì)照組,高糖組,PKC-δ過(guò)表達(dá)組及空載體對(duì)照組。首先等電聚焦,程序?yàn)?50V2h,500V1h,1000V1h快速,10000V6 h,最后聚焦至70000Vh。第二向SDS-PAGE將各組核蛋白按分子量區(qū)分開,PDQuest軟件分析后找出差異點(diǎn)。胰酶消化各差異蛋白點(diǎn)得到相應(yīng)肽段,并送質(zhì)譜分析其肽指紋圖譜。
　　 5.生物信息學(xué)分析
　　 將指

9、肽指紋數(shù)據(jù)輸入生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)中(Mascot),根據(jù)蛋白分子量、等電點(diǎn)及序列覆蓋百分比等搜索相關(guān)蛋白質(zhì)信息。
　　 結(jié)果:
　　 1.高糖條件下胞漿中平均熒光強(qiáng)度較正糖條件下增加了1.6倍,胞漿/胞核熒光比減少,PKC-δ過(guò)表達(dá)后,細(xì)胞熒光強(qiáng)度進(jìn)一步提高了1.8倍,且胞漿/胞核熒光比明顯減少(1.49±0.17 vs2.31±0.33,p<0.05)。
　　 2.正糖條件下,約(4.1±0.67)％的細(xì)胞發(fā)生早期

10、凋亡,而高糖條件下凋亡率為(22±2.7)％,兩者有顯著差異。高糖也促使細(xì)胞明顯阻滯于G0/G1期,約為正糖組的1.3倍。PKC-δ過(guò)表達(dá)則導(dǎo)致高糖條件下的進(jìn)一步的周期阻滯和凋亡(p<0.05),而rottlerin(10umol/L)特異性抑制其表達(dá)后,凋亡率減少了約80％且細(xì)胞阻滯恢復(fù)至正常對(duì)照水平。
　　 3.通過(guò)雙向電泳每組得到近600個(gè)蛋白點(diǎn),通過(guò)組內(nèi)及組間比照,發(fā)現(xiàn)51個(gè)蛋白表達(dá)量發(fā)生了明顯變化,并定義為高糖誘導(dǎo)下的

11、PKC-δ相關(guān)蛋白。質(zhì)譜分析后,51個(gè)蛋白點(diǎn)均得到滿意的肽指紋圖譜。
　　 4.通過(guò)生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)查詢,51組PMF篩選出對(duì)應(yīng)的37個(gè)蛋白點(diǎn)并分類,它們分別涉及到細(xì)胞周期及凋亡調(diào)節(jié)、腫瘤抑制、轉(zhuǎn)錄、應(yīng)激和核內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等。其中,SGK1、CCND3、CDKN2A、hLin-9、RAPL、GRP78均參與多種細(xì)胞凋亡及周期調(diào)控通路。
　　 結(jié)論:
　　 本研究表明,PKC-δ系高糖誘導(dǎo)的HUVEC周期阻滯及凋亡的重