微囊藻毒素誘導(dǎo)SD大鼠睪丸支持細(xì)胞凋亡效應(yīng).pdf

1、微囊藻毒素(Microcystins,MCs)是由水華藍(lán)藻產(chǎn)生的一類多肽化合物,現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)80多種MCs,MC-LR是研究較深入的一種。在關(guān)于MCs對生殖系統(tǒng)的毒性作用研究中,多涉及生殖器官、精子質(zhì)量和相關(guān)激素,而關(guān)于細(xì)胞分子水平的機(jī)制研究報道尚少。
　　 目的：
　　 本研究利用體外培養(yǎng)的大鼠睪丸支持細(xì)胞為模型研究MC-LR對生殖細(xì)胞活性的影響及其誘導(dǎo)支持細(xì)胞的凋亡,同時檢測凋亡相關(guān)基因P53、bax和bcl-2mRNA

2、及蛋白水平的表達(dá),從基因及蛋白水平闡述MC-LR對生殖細(xì)胞的凋亡的調(diào)控作用。
　　 方法：
　　 1.從未成年雄性SD大鼠睪丸分離純化睪丸支持細(xì)胞,建立原代培養(yǎng)細(xì)的胞模型。
　　 2.用甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)和中性紅(neutralred,NR)實(shí)驗(yàn)檢測MC-LR對支持細(xì)胞活性的影響。
　　 3.Hoechst熒光染色法檢測MC-LR誘導(dǎo)的凋亡睪

3、丸支持細(xì)胞。
　　 4.反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Reverse transcription—polymerase chain reaction,RT-PCR)法檢測MC-LR染毒后細(xì)胞中凋亡相關(guān)基因p53、bcl-2、bax mRNA水平的表達(dá)情況。
　　 5.Western blot法檢測不同劑量MC-LR染毒不同時間對支持細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白P53、Bcl-2、Bax的影響。
　　 6.Caspase-3底物切除法

4、檢測MC-LR對細(xì)胞中caspase.3的活性改變。
　　 結(jié)果：
　　 1.低劑量MC-LR(0.02～1μg／ml)染毒睪丸支持細(xì)胞24h和48h后,MTT和NR檢測結(jié)果顯示細(xì)胞活性升高。高劑量MC-LR(10μg／ml和20μg／ml)染毒24h和48h細(xì)胞活性顯著降低(P<0.05)。
　　 2.Hoechst熒光染色結(jié)果:隨著MC-LR劑量的增高誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞增多。
　　 3.RT-PCR結(jié)果:

5、支持細(xì)胞暴露MC—LR24h,10μg／ml劑量組中p53 mRNA相對表達(dá)量與對照組相比明顯升高(P<0.05)。1μg／ml劑量組bcl-2 mRNA相對表達(dá)量升高(P<0.05),10μg／ml組表達(dá)量明顯降低(P<0.05)。bax mRNA在10μg／ml劑量組細(xì)胞中相對表達(dá)明顯升高且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；暴露48h后各目的基因mRNA相對表達(dá)量與暴露24h時的趨勢相同,但其10μg／ml組與對照組相比表達(dá)量的變化

6、更明顯且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　 4.Western blot結(jié)果:睪丸支持細(xì)胞暴露于MC-LR24h,與對照相比1μg／ml劑量組P53蛋白相對表達(dá)量升高且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),Bax和Bcl-2蛋白相對表達(dá)量改變不明顯。10μg／ml劑量組P53和Bax蛋白相對表達(dá)量顯著升高(P<0.05),Bcl-2相對表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。
　　 MC-LR作用支持細(xì)胞48h后,1μg／m

7、l劑量組P53蛋白表達(dá)量升高但差異無統(tǒng)計學(xué)意義,Bax表達(dá)量顯著降低(P<0.05),Bcl.2表達(dá)量則顯著升高(P<0.05)。10μg／ml劑量組P53和Bax相對表達(dá)量顯著升高(P<0.05),Bcl-2表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。
　　 5.Caspase-3檢測結(jié)果:支持細(xì)胞染毒MC-LR24h和48h,與對照組相比1μg／ml劑量組細(xì)胞中caspase-3活性變化不明顯；10μg／ml劑量組細(xì)胞中caspase-