水解乳清蛋白的連續(xù)循環(huán)切向流酶膜反應(yīng)器的優(yōu)化及穩(wěn)定性研究.pdf

1、酶法制備具有生物活性的蛋白水解物及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用正受到越來越多的重視。具有特定功能的蛋白水解物可以用作功能性食品配料或添加到運(yùn)動型飲料中，還可以作為臨床營養(yǎng)食品適用于對大分子蛋白質(zhì)有代謝缺陷的人群。 將超濾/納濾膜技術(shù)和水解反應(yīng)器結(jié)合起來，可以實現(xiàn)水解物從酶解產(chǎn)物中的連續(xù)分離。對于乳蛋白(酪蛋白和乳清蛋白)及其它種類蛋白的酶水解而言，酶膜反應(yīng)(EMR)是一條新興的工藝路線。與分批式水解相比，酶膜反應(yīng)中酶可以反復(fù)利用，抑制酶

2、反應(yīng)的水解產(chǎn)物能夠及時分離。 本研究利用酶膜反應(yīng)器水解乳清分離蛋白，考察了各種因素對酶膜反應(yīng)的影響，并采用可靠的統(tǒng)計分析方法旨在揭示因素間的復(fù)雜關(guān)系，同時還對影響膜通量動力學(xué)的酶水解條件進(jìn)行了研究和優(yōu)化，最后對水解產(chǎn)物的免疫活性、抗氧化活性及等電點(diǎn)溶解性進(jìn)行了研究。 首先在1 L批式反應(yīng)器中對水解乳清分離蛋白(WPI)的酶進(jìn)行了篩選。分別以2％(v/v)的WPI乳清分離蛋白和2％(v/v)的酪蛋白為底物，測定并比較了Al

3、calase 2.4L.(EC 3.4.21.62)、Flavourzyme(EC 3.4.11.1)、Protease A(EC 3,4.24,39)及Protease N(IUB 3.4,24.28)4種酶的酶活，并測定了反應(yīng)結(jié)束后的殘余酶活、水解產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量分布以及游離氨基酸含量。結(jié)果表明：Protease N和Alcalase 2.4L分別對WPI和酪蛋白的水解活性最高。水解WPI時，Alcalase 2.4L、Prote

4、ase N和Protease A都能產(chǎn)生短肽，但Alcalase 2.4L不易被底物抑制，ProteaseN易被水解產(chǎn)物抑制，而Protease A則釋放出大量的游離氨基酸。Flavourzyme對WPI的水解能力最弱，水解釋放的游離氨基酸也最多。在用反相高壓液相色譜(RP-HPLC)分析游離氨基酸之前，采用5％三氯乙酸(TCA)和3.5％磺基水楊酸(SSA)能沉淀除去Flavourzyme和Protease A水解產(chǎn)物中的短肽，而對A

5、lcalase 2.4L和Protease N酶解產(chǎn)物中短肽的去除效果并不明顯。 水解WPI的各種酶按活性排列依次為Flavourzyme

6、凝的問題。酶膜反應(yīng)可以及時分離水解產(chǎn)物，因此消除了產(chǎn)物對Protease N的抑制作用。 本文研究并建立了一種簡便可靠的方法來監(jiān)控酶膜反應(yīng)過程中酶的變化。酶的變化可以表示為殘余酶活(A<,residual>)，酶的滲漏(A<,leakage>)及酶的損失(A<,loss>)之間的一種平衡，對實驗結(jié)果的分析僅需1h。 采用響應(yīng)面(RSM)中心點(diǎn)旋轉(zhuǎn)設(shè)計方法考察和優(yōu)化了酶膜反應(yīng)器中水解WPI的操作參數(shù)，并通過主成分分析法(P

7、CA)對實驗結(jié)果進(jìn)行了多元數(shù)據(jù)分析。WPI的酶解條件為：在10 kDa或3 kDa的切向流(TFF)酶膜反應(yīng)器中，采用Protease N對初始濃度為5％(w/v)的WPI在55℃，pH 7.0條件下連續(xù)水解5h。響應(yīng)面實驗選取的三個因素及其水平分別為：進(jìn)料溫度(A:25-55℃)，初始膜透水量Ji(B:1.6-18.4 mL/min)和加酶量(C:0.5-5.5g)。響應(yīng)變量分別為：殘余酶活，酶的滲漏，酶的損失，平均膜通量以及透過液中

8、的蛋白質(zhì)回收率。由于酶解時采用的ProteaseN最適作用溫度為55℃，因此當(dāng)進(jìn)料溫度低于55℃時，在膜的入口和出口處分別加裝了能冷卻和再加熱的溫控裝置。實驗結(jié)果表明：進(jìn)料溫度低至25.30℃時，J<,average>大幅下降，50℃時高活性的酶能水解溶化膜表面的動態(tài)凝膠層，使得J<,average>得到穩(wěn)定，同時S<,apparenl>和A<,leakage>增加，而A<,residual>下降J<,average>和S<,appar

9、ent>隨著進(jìn)料溫度、J<,i>和酶濃度的增加而升高。Protease N酶活損失的主要原因有：低膜通量時的產(chǎn)物抑制作用，低酶濃度時的底物抑制作用，以及高膜通量和高進(jìn)料溫度時酶的滲漏加劇。酶膜反應(yīng)時高的循環(huán)速率還能防止底物沉積于膜上，從而有助于維持較高的J<,average>。 由響應(yīng)面分析并優(yōu)化后得到的最佳工藝條件是：WPI濃度，約5％；J<,i>，約15 mL/min；進(jìn)料溫度，50℃：加酶量：約3.0 g/1000 mL。

10、在此優(yōu)化條件下進(jìn)行驗證實驗，結(jié)果與模型預(yù)測值十分吻合。在最佳條件下，單獨(dú)使用10 kDa或3kDa的一步酶膜反應(yīng)，蛋白質(zhì)回收率分別為68.48％和45.24％，J<,average>分別為79.41％和40.00％，而A<,residual>分別為34.63％和48.44％。將經(jīng)過10 kDa反應(yīng)的水解液再通過3 kDa的兩步酶膜反應(yīng)中，第二階段(3 kDa)回收的蛋白質(zhì)占第一階段(10 kDa)回收蛋白質(zhì)的52.86％，占原料總蛋白質(zhì)

11、的21.62％。第二階段的J<,average>和A<,residual>分別為78.26％和54.50％。單獨(dú)使用10 kDa和3 kDa的一步反應(yīng)的Aresldual分別為48.44％．34.63％。主成分分析顯示：PCI和PC3(透過液和底物的動力學(xué)特性)累計方差貢獻(xiàn)率約達(dá)到酶膜反應(yīng)原始信息的60％，其中進(jìn)料溫度、S<,apparent>、A<,leakage>和J<,average>四個因素對這兩個主成分有顯著的影響：PC2(反

12、映酶在反應(yīng)器中的殘留率)的方差貢獻(xiàn)率為27.78％。因此，當(dāng)進(jìn)料溫度合適時，膜表面上底物的溶解性好且體系的粘度低，再加上高活性的酶可以水解膜表面的凝膠層，從而有利于獲得穩(wěn)定的膜通量及較高的產(chǎn)物得率。 目前，用酶膜反應(yīng)水解蛋白質(zhì)時缺少一種標(biāo)準(zhǔn)的方法來計算水解度(DH)。所以本研究設(shè)計了一種新方法，在使用10 kDa或3 kDa的膜進(jìn)行水解乳清蛋白時用其測定產(chǎn)物水解度。使用Protease N在pH 7.0，55℃的條件下連續(xù)水解W

13、PI，產(chǎn)生的水解物及時通過膜得到分離。透過液DH(DH<,permeate>)和回流液DH(DH<,retentate>)可通過使用2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)測定游離α-NH<,2>的濃度來計算?？偯改し磻?yīng)DH(DH<,EMR>)可以通過DH<,permeate>和DH<,retentate>經(jīng)計算得出。DH<,EMR>代表酶膜反應(yīng)水解過程中的真實DH，和使用pH-stat方法得到的DH相比，發(fā)現(xiàn)后者值偏高，而通過水解產(chǎn)物的相

14、對分子質(zhì)量和游離氨基酸分析也證明了由pH-stat得出的DH并不合理。DH<,EMR>仍保留了在分批式水解過程中廣泛應(yīng)用的DH的內(nèi)涵，即提供了一個有用的參數(shù)能夠直觀地將水解物與它們的功能性質(zhì)和/或生物活性聯(lián)系起來。用TNBS方法評價酶膜反應(yīng)中的DH更可靠。采用10 kDa的TFF進(jìn)行一步反應(yīng)，DH<,permeate>，DH<,retentate>和DH<,EMR>分別為36.05％，12.81％和27.12％。采用3 kDa的TFF進(jìn)

15、行一步反應(yīng)，以上的值則分別為38.63％，14.06％和27.27％。而兩步反應(yīng)后，以上的值則為63.20％，29.74％和73.80％。 為了證實酶膜反應(yīng)器的作用效果，需對水解產(chǎn)物的功能、生物活性以及免疫特性進(jìn)行研究。對最優(yōu)條件下一步(10 kDa或3 kDa)或兩步(先10 kDa后3kDa)酶膜反應(yīng)得到的水解產(chǎn)物經(jīng)非極性苯乙烯基大孔吸附樹脂(MAR)吸附，用去離子水洗滌除去堿，然后分別以25％、50％和95％(v/v)的乙

16、醇階段解吸。雖然酶膜反應(yīng)的水解度是分批式水解的2～3倍，但前者透過產(chǎn)物中的灰份含量低于后者。采用MAR吸附乙醇解吸的處理方式顯著降低了水解產(chǎn)物的灰份含量，蛋白質(zhì)回收率也相應(yīng)較高。 和天然WPI相比，所有未脫鹽回流產(chǎn)物的競爭性抑制酶聯(lián)免疫吸附測定(Cl-ELISA)活力均更高。本研究引入了IC<,50>來分析ELISA的實驗結(jié)果。脫鹽后的一些組分的ELISA活力有良好的量效關(guān)系。與天然的WPI相比，所有水解產(chǎn)物均有更高的等電點(diǎn)(p

17、1)溶解性，而脫鹽組分具有更強(qiáng)的2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl(DPPH)自由基清除能力。兩步反應(yīng)的透過產(chǎn)物經(jīng)脫鹽處理后具有較低的ELISA活力和較好的p1溶解性，以及最高的DPPH自由基清除能力。采用PCA處理數(shù)據(jù)，三個主成分累計方差貢獻(xiàn)率達(dá)到水解產(chǎn)物原始信息的86.67％。其中，水解產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量影響最顯著(PCI=57.35％)，其次為ELISA活力(PC2=18.90％)和抗氧化能力(PC3=1