胍鹽離子液體用于中藥和蛋白質(zhì)的分離分析及細胞機電性質(zhì)研究.pdf

1、離子液體作為一種綠色溶劑，具有許多獨特的物理化學(xué)性質(zhì)，已獲得廣泛關(guān)注。離子液體雙水相萃取技術(shù)是提取和純化生物活性物質(zhì)的一種新型分離方法。功能化離子液體雙水相體系能有效地將離子液體與雙水相萃取技術(shù)的優(yōu)點相結(jié)合，具有無毒、安全、簡便、快速的特點，已被廣泛應(yīng)用于生物轉(zhuǎn)化，分離純化蛋白質(zhì)、核酸和病毒等多個研究領(lǐng)域。功能化離子液體磁性固相萃取技術(shù)是在磁性固相萃取劑的表面修飾上功能化離子液體，從而形成具有某種特定功能或者應(yīng)用的一種新型固相萃取技術(shù)。

2、
　　胍鹽離子液體是離子液體家族中的新成員，它合成簡單、熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性高、生物活性強、具有很好的可設(shè)計性。
　　本研究前3個工作設(shè)計合成了胍鹽離子液體，結(jié)合微波萃取技術(shù)用于中藥前胡有效成分的分離分析;將胍鹽離子液體進行功能化，結(jié)合雙水相萃取技術(shù)和磁性固相萃取技術(shù)，建立了萃取分離蛋白質(zhì)的方法。
　　隨后由于赴加州大學(xué)洛杉磯分校進行博士聯(lián)合培養(yǎng)（2014年9月-2016年7月），本研究后3個工作轉(zhuǎn)化為心肌細胞電生理性

3、質(zhì)的研究和癌細胞的機械性質(zhì)研究，從電生理的角度考察了心肌細胞的成熟過程，并探究了葡萄糖在心肌細胞成熟過程中所扮演的角色，為細胞電生理活動的研究提供了一種有效方法。以膀胱癌細胞為樣本，提出了一種從單細胞層面檢測癌細胞機械性質(zhì)的方法。論文主要內(nèi)容如下:
　　(1)胍鹽離子液體微波輔助萃取中藥前胡中的白花前胡甲素
　　提出了一種胍鹽離子液體微波輔助萃取法，對中藥前胡的活性成分——白花前胡甲素進行萃取。萃取后，反相高效液相色譜結(jié)合紫

4、外檢測器用于白花前胡甲素含量的測定。通過單因素實驗和三水平四因素正交實驗優(yōu)化了萃取工藝參數(shù)，白花前胡甲素萃取量最高值達到11.92±0.10 mg/g。將所擬萃取方法與胍鹽離子液體熱回流萃取法、胍鹽離子液體冷浸萃取法和胍鹽離子液體超聲輔助萃取法進行比較，發(fā)現(xiàn)胍鹽離子液體微波輔助萃取法萃取率最高，耗時最短。白花前胡甲素在0.005-0.200 mg/mL范圍內(nèi)峰面積與濃度線性關(guān)系良好，最低檢出限為2.07μg/mL，樣品的回收率在99.2

5、3-100.07％之間。方法學(xué)考察結(jié)果表明:本研究建立的分析方法精密度、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性均良好，其中精密度實驗與重現(xiàn)性實驗所得相對標準偏差(RSD)分別為0.34％和0.52％，穩(wěn)定性實驗中標準溶液的白花前胡甲素RSD為0.67％，萃取溶劑中的白花前胡甲素RSD為1.0％。采用動力學(xué)曲線、場發(fā)射掃描電子顯微鏡(SEM)和傅立葉變換紅外光譜技術(shù)(FTIR)對前胡萃取前后殘渣的表面微觀結(jié)構(gòu)和成分進行了研究，初步探討了胍鹽離子液體微波輔助萃取法

6、的萃取機理。最后將所擬方法用于前胡實際藥材分析，結(jié)果表明:因產(chǎn)地不同，藥材中白花前胡甲素的含量差異顯著。
　　(2)功能化胍鹽離子液體雙水相萃取蛋白質(zhì)
　　合成了一系列新型的陽離子功能化六烷基胍鹽離子液體和陰離子功能化四烷基胍鹽離子液體，將這些功能化離子液體與磷酸鹽溶液形成雙水相體系用于蛋白質(zhì)的萃取分離分析。采用紫外光譜分析法在278 nm處對代表性蛋白質(zhì)BSA進行定性及定量分析檢測。研究采用單因素實驗優(yōu)化了萃取參數(shù)，其萃取

7、工藝參數(shù)的最佳組合為:離子液體用量4.0 mmol，鹽溶液濃度0.6 g/mL，溫度25℃，蛋白質(zhì)加入量在12-24 mg區(qū)間內(nèi)，得到蛋白質(zhì)的最高萃取率為97.05％。在同等條件下，比較了功能化胍鹽離子液體雙水相體系與普通離子液體雙水相體系的萃取能力，發(fā)現(xiàn)功能化胍鹽離子液體雙水相體系成相能力更強，萃取率更高。方法學(xué)考察結(jié)果表明:本研究建立的分析方法精密度、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性均良好，其RSD分別為1.1％、1.6％和1.8％。采用動態(tài)光散射法

8、(DLS)、電導(dǎo)率測定法和透射電鏡技術(shù)(TEM)對離子液體雙水相體系萃取蛋白質(zhì)的機理進行了研究，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)粒子和離子液體粒子在萃取過程中發(fā)生了簇集。并通過紫外光譜(UV)、紅外光譜(FTIR)和園二色譜(CD)對蛋白質(zhì)萃取前后結(jié)構(gòu)變化進行了研究，結(jié)果表明:萃取后，蛋白質(zhì)分子的二級結(jié)構(gòu)并沒有被破壞。
　　(3)功能化胍鹽離子液體修飾的磁性顆粒固相萃取蛋白質(zhì)
　　制備了磁性殼聚糖-氧化石墨烯磁性顆粒(MCGO)，將它分別修飾上不

9、同的新型功能化胍鹽離子液體(FGILs)，以此作為固相萃取劑(MCGO-FGILs)，結(jié)合磁性固相萃取技術(shù)，用于蛋白質(zhì)的萃取分離分析。通過紅外光譜(FTIR)、振動樣品磁強計(VSM)、掃描電子顯微鏡(SEM)、X射線衍射(XRD)對所合成的磁性固相萃取劑進行了表征。采用紫外光譜分析法在278 nm處對蛋白質(zhì)進行定性及定量分析檢測。經(jīng)過一系列單因素實驗獲得最優(yōu)萃取條件為:蛋白質(zhì)濃度2.5mg/mL，MCGO-FGILs加入量12 mg，

10、pH值5.0，溫度30℃，萃取時間30分鐘。得到的萃取容量分別為:18.9833 mg/g(BSA)，20.6725 mg/g(OVA)，35.2640 mg/g(Try)，38.4006 mg/g(Lys)。將MCGO-FGILs與磁性殼聚糖(MC)、氧化石墨烯(GO)、磁性殼聚糖-氧化石墨烯磁性顆粒(MCGO)進行了比較，發(fā)現(xiàn)MCGO-FGILs的萃取量最高，達到48.8 mg/g。用1.0％ NaOH溶液做洗脫液，考察了MCGO-

11、FGILs的洗脫和重復(fù)利用能力，發(fā)現(xiàn)使用三次之后，MCGO-FGILs的萃取能力仍有94.0％。方法學(xué)考察結(jié)果表明儀器精確性、方法重現(xiàn)性和穩(wěn)定性良好，其相對標準偏差(RSD)分別為1.3％、1.7％和1.0％。
　　(4)小鼠胚胎干細胞分化的心肌細胞成熟過程中電生理特性研究
　　設(shè)計了一個由小鼠胚胎干細胞分化的心肌細胞二維融合層構(gòu)成的細胞外場電位檢測體系，利用微電極陣列系統(tǒng)從電生理角度對細胞的成熟情況進行了實時監(jiān)測。所得信號

12、類似心電圖，通過對細胞心跳間期、場電位振幅、場電位持續(xù)時間、傳導(dǎo)速度、去極化過程進行分析，發(fā)現(xiàn)在小鼠心肌細胞的成熟過程中，細胞的場電位振幅和傳導(dǎo)速度隨細胞逐漸成熟得到了增長，而心跳間期和場電位持續(xù)時間始終保持穩(wěn)定，其中心跳間期始終維持在1.5 s左右，場電位持續(xù)時間維持在0.2-0.4 s之間。利用Matlab軟件從時間和空間的角度對細胞電信號進行分析，找到了心肌細胞的起博點位置并得到了電信號的傳播趨勢，對細胞的成熟過程進行了表征，為下

13、一章的工作奠定了基礎(chǔ)。
　　(5)葡萄糖缺乏對人體胚胎干細胞分化的心肌細胞成熟過程的影響研究
　　設(shè)計了一個由人體胚胎干細胞分化的心肌細胞二維融合層構(gòu)成的細胞外場電位檢測體系，利用微電極陣列系統(tǒng)從電生理角度對細胞的成熟情況進行實時監(jiān)測。通過對比實驗研究了葡萄糖對心肌細胞成熟過程的影響。利用Matlab軟件對細胞的心跳間期、場電位振幅、場電位持續(xù)時間、傳導(dǎo)速度及去極化過程進行了分析，發(fā)現(xiàn)人體胚胎干細胞分化的心肌細胞在葡萄糖缺乏

14、條件下場電位振幅、電信號傳導(dǎo)速度和去極化過程分別從420.6μV、31.9 mm/s和2.8μV/ms增長為609.8μV、89.5 mm/s和17.2μV/ms，表明心肌細胞在葡萄糖缺乏條件下成熟度得到了很大提高，說明葡萄糖缺乏能夠促進心肌細胞的成熟。
　　(6)膀胱癌細胞的機械性質(zhì)表征研究
　　研究得出了一種基于單細胞層面的膀胱癌細胞機械性質(zhì)檢測法，利用原子力顯微技術(shù)研究了膀胱癌細胞在4-氨基聯(lián)苯處理下的硬度變化，發(fā)現(xiàn)細

15、胞癌變后楊氏模量均有降低。通過對原子力顯微鏡的針尖進行精確控制，確保針尖始終按壓于細胞核的區(qū)域。利用Matlab軟件對所得的大量數(shù)據(jù)進行了處理分析，對原子力顯微鏡獲得的力學(xué)曲線進行分段擬合計算楊氏模量，探討了不同按壓程度下的細胞硬度，發(fā)現(xiàn)當按壓深度從100 nm上升至1000 nm后，細胞的楊氏模量從100 kPa迅速降低至10 kPa以下。利用Origin軟件、Matlab軟件構(gòu)建了直觀二維陣列圖，發(fā)現(xiàn)圖中按壓深度峰的位置轉(zhuǎn)移能很好地