孕期低蛋白飲食對子代大鼠骨骼肌葡萄糖代謝的影響及其表觀遺傳機(jī)制探討.pdf

1、研究背景
　　胎兒生長受限(fetalgrowthrestriction，F(xiàn)GR)包括宮內(nèi)生長遲緩(intrauterinegrowthretardation，IUGR)和低出生體重(lowbirthweight，LBW)，是造成圍產(chǎn)兒死亡和發(fā)病的重要原因之一。代謝綜合征（metabolicsyndrome，MS）是以中心性肥胖、糖尿病或糖調(diào)節(jié)受損、高血壓、血脂異常等多種代謝性疾病合并出現(xiàn)為臨床特點(diǎn)的一組癥候群。目前流行病學(xué)和臨床

2、研究已在不同國家、不同種族人群中證實(shí)了低出生體重是成年后發(fā)生MS的高危因素[1]。因而研究低出生體重引起成年后MS的機(jī)制，以及實(shí)施成年期疾病的早期防治已成為一個研究熱點(diǎn)。出于醫(yī)學(xué)倫理學(xué)的考慮，不能直接在人體上進(jìn)行試驗，因此必須建立合適的低出生體重動物模型用于實(shí)驗研究。胎源假說、營養(yǎng)程序化和代謝程序化等理論的提出為孕期低蛋白飲食法建立低出生體重大鼠模型提供了理論基礎(chǔ)。
　　胰島素抵抗(insulinresistance，IR)是MS

3、發(fā)生的共同病理生理機(jī)制。骨骼肌是胰島素發(fā)揮生物效應(yīng)的重要外周組織之一[2]。胰島素發(fā)揮代謝調(diào)節(jié)作用必須通過胰島素受體底物蛋白激活磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositide-3kinase，PI3K)途徑。最終通過葡萄糖在骨骼肌細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)，增加葡萄糖的攝取，而葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(glucosetransporter，GLUT4)是葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的重要成員之一，位于胰島素信號傳遞途徑的最下游，胰島素刺激后GLUT4由細(xì)

4、胞漿向細(xì)胞膜的移位過程是胰島素誘導(dǎo)的外周組織攝取葡萄糖的限速步驟，與胰島素抵抗密切相關(guān)，GLUT4的表達(dá)或活性降低以及調(diào)控中任何環(huán)節(jié)出現(xiàn)異常都將引起胰島素信號傳導(dǎo)減弱或受阻，導(dǎo)致胰島素抵抗形成，影響其調(diào)節(jié)糖代謝等生理效應(yīng)的發(fā)揮[3]。過氧化物酶增殖激活受體-共激活子-1α(peroxisomeproliferators-activatedreceptorγcoactivator1，PGClα)為核編碼轉(zhuǎn)錄共激活子，是調(diào)節(jié)氧化磷酸化的關(guān)鍵

5、代謝因子，可協(xié)同激活多種因子，廣泛調(diào)節(jié)能量的生成與利用，誘導(dǎo)GLUT4基因表達(dá)，在轉(zhuǎn)錄水平上激活糖異生關(guān)鍵酶組，包括磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶、葡萄糖-6-磷酸酶，從而影響血糖代謝[4]。
　　表觀遺傳學(xué)(epigenetics)是指基于非基因序列改變所致基因表達(dá)水平變化，如DNA甲基化、組蛋白修飾和染色質(zhì)重塑等[5]。已經(jīng)有研究證實(shí)，DNA甲基化可能參與了IUGR發(fā)展為T2DM的進(jìn)程[6]，對T2DM相關(guān)基因的表觀遺傳學(xué)調(diào)控進(jìn)行研究

6、可能是控制IUGR發(fā)展為MS的途徑之一。最近，關(guān)于基因表觀遺傳的研究顯示某些關(guān)鍵基因啟動子區(qū)域CpG島甲基化狀態(tài)與代謝程序化密切相關(guān)。Lillycrop等[7]研究表明給予孕期大鼠蛋白限制(PR)飲食將使子代肝臟糖皮質(zhì)激素受體(GR)和過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPARα）分子啟動子低甲基化從而使得它們的基因表達(dá)增加。這些研究充分說明了出生之前的營養(yǎng)狀態(tài)可通過表觀遺傳的改變進(jìn)而對子代表型產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。
　　基于IUGR作為2

7、型糖尿病的重要危險因素，我們采用給予孕鼠低蛋白飲食成功制造子代IUGR模型。為了避免性別和激素的混雜因素，我們僅僅選取雌性子代作為研究對象，觀察IUGR大鼠自幼年至成年期體重、血糖、血清胰島素水平、胰島素抵抗指數(shù)等的變化以評估機(jī)體水平胰島素抵抗;觀察老年IUGR大鼠骨骼肌葡萄糖攝取以及葡萄糖代謝相關(guān)基因表達(dá)以評估骨骼肌組織水平胰島素抵抗;進(jìn)一步根據(jù)基因表達(dá)結(jié)果分析篩選出候選基因分析其啟動子區(qū)域甲基化的狀態(tài)，深入探討IUGR子代代謝表型改

8、變的原因和機(jī)制。
　　目的
　　1)本實(shí)驗給予孕鼠孕期全程低蛋白（10％蛋白）飲食，觀察所生仔鼠數(shù)目、平均體重、IUGR發(fā)生率及圍產(chǎn)期死亡率，檢驗該方法是否能用于制造宮內(nèi)發(fā)育遲緩(IUGR)模型。
　　2)分析低出生體重大鼠生后自幼年期、成年期直至老年期生長發(fā)育的規(guī)律以及空腹血糖、血清胰島素、胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IRI)以及葡萄糖負(fù)荷下的胰島素釋放能力的變化，評估IUGR大鼠發(fā)生機(jī)體水平胰島素抵抗的狀態(tài)。

9、　　3)在低出生體重大鼠模型上觀察老年期IUGR大鼠骨骼肌在胰島素刺激下的葡萄糖攝取情況以評估IUGR大鼠骨骼肌發(fā)生組織水平胰島素抵抗的狀態(tài)。
　　4)分析老年雌性IUGR大鼠骨骼肌組織中胰島素信號傳導(dǎo)途徑中重要分子IR、IRS-1、GLUT4和調(diào)節(jié)葡萄糖代謝的重要轉(zhuǎn)錄因子PGClα的mRNA和蛋白表達(dá)情況，探討IUGR個體發(fā)生胰島素抵抗的分子機(jī)制。
　　5)分析老年雌性IUGR大鼠骨骼肌標(biāo)本給予胰島素刺激前后，骨骼肌總GL

10、UT4蛋白和細(xì)胞膜GLUT4蛋白的表達(dá)情況以評估胰島素刺激下GLUT4的轉(zhuǎn)位情況。
　　6)分析老年雌性IUGR大鼠骨骼肌葡萄糖代謝關(guān)鍵基因——GLUT4和PGClα啟動子區(qū)域甲基化的狀態(tài)，研究GLUT4和PGClα表達(dá)異常的機(jī)制，深入探討IUGR子代代謝表型改變的原因和機(jī)制，進(jìn)一步為宮內(nèi)發(fā)育遲緩相關(guān)代謝病的防治提供理論依據(jù)。
　　方法
　　1)低出生體重大鼠模型的建立和實(shí)驗分組:分別選取健康3m齡Sprague-Da

11、wley(SD)雌性和雄性大鼠18只和6只。按照雌雄3∶1的比例同一籠中交配，次日清晨檢測出陰栓者定為受孕成功，進(jìn)入實(shí)驗分組。受孕成功的孕鼠隨機(jī)分為對照組和低蛋白飲食組。對照組母鼠自受孕后第1d開始給予21％正常蛋白飲食，而低蛋白飲食組母鼠自受孕后第1d開始給予10％蛋白飲食。以對照組活仔鼠平均出生體重減去2個標(biāo)準(zhǔn)差作為IUGR的診斷標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)出生體重將大鼠分為對照組(CON)和宮內(nèi)發(fā)育遲緩組(IUGR)，為避免性別和激素的影響，本研究

12、只選取雌性大鼠做為研究對象。兩組大鼠從出生至21日的哺乳期內(nèi)，均給予母鼠21％正常蛋白飲食喂養(yǎng)并自由飲水。出生21d后將母鼠、仔鼠分籠，后繼續(xù)給兩組大鼠21％正常蛋白飲食喂養(yǎng)自由飲水，喂養(yǎng)至18m。
　　2)兩組大鼠每周稱量體重，并選擇3w（幼年期）、8w（青春期）、6m（成年期）和18m（老年期）作為觀察的4個時間點(diǎn)，每個時間點(diǎn)每組6只大鼠，測量大鼠體重、取血和骨骼肌標(biāo)本。測定空腹血糖、血清胰島素值，計算胰島素抵抗指數(shù)（HOMA

13、-IRI）。
　　3)選取18m齡老年雌性大鼠行腹腔內(nèi)注射葡萄糖糖耐量試驗(IGTT)試驗并分別計算血糖和血胰島素在IGTT實(shí)驗中曲線下面積(areaunderthecurve，AUC)，以評估IUGR大鼠發(fā)生機(jī)體水平胰島素抵抗的狀態(tài)。
　　4)選取18m齡老年雌性大鼠骨骼肌標(biāo)本分別放入含/不含胰島素的KHB緩沖液中孵育后，檢測2-D-3H葡萄糖的攝取以評估IUGR大鼠骨骼肌發(fā)生組織水平胰島素抵抗的狀態(tài)。
　　5)提取

14、18m齡老年雌性大鼠骨骼肌組織mRNA，采用實(shí)時熒光RT-PCR方法檢測胰島素信號傳導(dǎo)途徑中重要分子IR、IRS-1、GLUT4和調(diào)節(jié)葡萄糖代謝的重要轉(zhuǎn)錄因子PGClα的mRNA表達(dá);同時提取總蛋白，用WesternBlot方法檢測相關(guān)基因的蛋白表達(dá)。
　　6)選取18m齡老年雌性大鼠骨骼肌標(biāo)本給予胰島素刺激前后，分別提取骨骼肌總蛋白和細(xì)胞膜蛋白，用WesternBlot方法分別檢測總GLUT4和細(xì)胞膜GLUT4的蛋白表達(dá)以評估胰

15、島素刺激下GLUT4的轉(zhuǎn)位情況。
　　7)提取18m齡老年雌性大鼠骨骼肌組織DNA，采用BSP法檢測骨骼肌GLUT4和PGC-1α啟動子區(qū)域的甲基化狀態(tài)。
　　8)采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。計量資料兩組間均數(shù)比較采用t檢驗，計數(shù)資料兩樣本比較用卡方檢驗。以P＜0.05為差異具有顯著性。
　　結(jié)果
　　1)孕期全程低蛋白飲食造模孕鼠的仔鼠平均出生體重明顯低于對照組(P＜0.001)，61.11％

16、達(dá)IUGR標(biāo)準(zhǔn)，而每窩產(chǎn)仔數(shù)和圍生期死亡率無明顯差異(P=0.743和P=0.580)。
　　2)兩組大鼠生長動態(tài)比較:與對照組相比,0d、1w、2w和3w齡IUGR大鼠體重明顯降低(P＜0.001，P＜0.001，P＜0.001和P=0.019)，4w和8w齡時，兩組比較無明顯差異(P=0.314和P=0.663);到12w、6m和18m齡時，IUGR大鼠體重明顯高于對照組(P＜0.001，P=0.039和P=0.012)。

17、r>　　3)兩組大鼠空腹血糖、空腹胰島素及胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IRI)比較:在3w、8w和6m齡時，對照組和IUGR大鼠血糖均無顯著差異(P＝0.668，P=0.323和P=0.211)，而18m齡時，IUGR大鼠血糖較對照組高，但尚無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.122）;在3w、8w和6m齡時，對照組與IUGR大鼠血清胰島素值無明顯差異(P＝0.635，P=0.194和P=0.205)，而18m齡時，IUGR大鼠血清胰島素值較對照組顯著

18、增高（P=0.042）;在3w、8w和6m齡時，對照組與IUGR大鼠HOMA-IRI無明顯差異（P=0.860，P=0.143和P=0.254），而18m齡時，IUGR大鼠HOMA-IRI較對照組顯著增高(P＝0.048)。
　　4)兩組大鼠血糖和血胰島素在IGTT實(shí)驗中的比較:腹腔下葡萄糖耐量（2g葡萄糖/公斤體重）實(shí)驗中，18m齡IUGR大鼠空腹血糖和胰島素均輕微高于對照組大鼠但無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.296和P=0.104)，

19、但在葡萄糖負(fù)荷后，IUGR大鼠在15min、30min和60min三個時間點(diǎn)的血糖和血胰島素均明顯高于對照組（P＜0.05），并導(dǎo)致相應(yīng)的血糖和血胰島素曲線下面積(AUC)均高于對照組(P＜0.05)。
　　5)兩組18m齡大鼠骨骼肌胰島素刺激下葡萄糖攝取比較:與對照組相比，18m齡IUGR大鼠骨骼肌的基礎(chǔ)葡萄糖攝取率較正常同齡大鼠略低（P＝0.149）;在接受了2IU/L胰島素刺激30min后，IUGR大鼠的葡萄糖攝取率較對照均

20、顯著降低(P=0.035)，提示IUGR大鼠骨骼肌組織存在胰島素抵抗。
　　6)兩組18m齡大鼠骨骼肌中IR、IRS-1、GLUT4和PGC1αmRNA的相對含量比較:IR和IRS-1mRNA表達(dá)在對照組和IUGR大鼠骨骼肌中無顯著性差異(P=0.259和P=0.227);而GLUT4和PGC1α表達(dá)在IUGR大鼠骨骼肌中較對照組顯著下降(P=0.031和P=0.042)。
　　7)兩組18m齡大鼠骨骼肌中IR、IRS-1和

21、PGC1α蛋白表達(dá)比較:IR和IRS-1蛋白表達(dá)在對照組和IUGR大鼠骨骼肌中無顯著性差異(P=0.525和P=0.075);而PGC1α表達(dá)在IUGR大鼠骨骼肌中顯著下降(P=0.023)。
　　8)兩組18m齡大鼠胰島素刺激前后骨骼肌GLUT4總蛋白和膜蛋白表達(dá)比較:①基礎(chǔ)狀態(tài)時，與對照組相比，IUGR組GLUT4總蛋白表達(dá)均無明顯差異(P=0.967);IUGR組GLUT4膜蛋白表達(dá)略降低，但未及統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.072)

22、;②經(jīng)胰島素刺激后，對照組和IUGR大鼠與各自基礎(chǔ)狀態(tài)相比，GLUT4總蛋白變化不明顯，GLUT4膜蛋白表達(dá)均較各自的基礎(chǔ)狀態(tài)顯著增加，但I(xiàn)UGR大鼠骨骼肌GLUT4膜蛋白的上升程度顯著低于對照組低(P=0.001)。
　　9)兩組18m齡大鼠骨骼肌GLUT4基因啟動子區(qū)CpG位點(diǎn)甲基化呈散在分布，無顯著性差異（P＞0.05）
　　10)兩組18m齡大鼠骨骼肌PGC1α基因啟動子區(qū)CpG位點(diǎn)甲基化率顯著高于對照組大鼠相應(yīng)的甲

23、基化率（16.18％vs9.31％，X2=4.879，P＜0.05）
　　結(jié)論
　　1)孕期全程10％低蛋白飲食法成功建立IUGR大鼠模型，制?？煽?，效果比較理想。
　　2)IUGR大鼠生長發(fā)育規(guī)律:IUGR大鼠出生時體態(tài)瘦小，后出現(xiàn)“追趕生長”，體重與正常鼠無明顯差異，但經(jīng)過青春期后，成年鼠直至老年鼠均較同齡正常大鼠肥胖。
　　3)6m齡內(nèi)IUGR大鼠尚未出現(xiàn)空腹血糖、血清胰島素和胰島素抵抗指數(shù)的異常，但18m

24、齡IUGR大鼠出現(xiàn)血清胰島素和胰島素抵抗指數(shù)升高，且IGTT葡萄糖負(fù)荷下血糖AUC和胰島素AUC增加，呈現(xiàn)外周胰島素抵抗并具有發(fā)生MS的傾向表現(xiàn)。
　　4)與同齡對照組大鼠相比，18m齡IUGR大鼠骨骼肌葡萄糖攝取下降、GLUT4mRNA降低以及PGC1αmRNA和蛋白表達(dá)降低。
　　5)與同齡對照組大鼠相比，18m齡IUGR大鼠骨骼肌基礎(chǔ)狀態(tài)下GLUT4總蛋白和膜蛋白無顯著差異;但胰島素刺激后IUGR大鼠骨骼肌中GLUT4