早期宮頸鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)EST的篩選及全長cDNA的克隆、驗證.pdf

1、目的：從全基因cDNA微陣列篩查出的與早期宮頸鱗癌(SquamousCervicalCarcinoma，SCC)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)的表達序列標簽(expressedsequencetags，EST)出發(fā)，獲得與早期SCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)的新基因或功能未鑒定的已知基因；進而從基因(mRNA)水平和蛋白水平在早期SCC中的進行驗證，為研究早期SCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的分子機制提供線索。 方法：首先將基因芯片所獲得的EST整理后送往NCBI的BLA

2、ST網(wǎng)頁，分別與NR(Non-RedundantGenBank+DDBJ+PDB)和人的dbEST子庫等數(shù)據(jù)庫進行同源性比較，將所有的EST聚類分析，結(jié)果為已登錄的同源基因和可能代表新基因的EST；而后，以EST(ADCAPE03、ADCAPB08)作為種子序列進行電子延伸，將延伸的結(jié)果及篩選出的已知基因MEG3、MIF進行生物信息學(xué)分析和克隆；最后，采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reversetranscriptionpolymerasec

3、hainreaction，RT-PCT)對ADCAPE03、SNRPN、MEG3、MIF在Ⅰb～Ⅱa期SCC組織中進行基因水平的驗證，并用免疫組織化學(xué)法(Immunohistochemistry，IHC)從蛋白水平檢測MIF在宮頸鱗癌組織和SiHa細胞株中的表達。 結(jié)果：(1)從芯片中篩選出15條EST，其中ID為ADCAPE03的序列差異倍數(shù)為10.14，可能是新的EST片段；ID為ADCAPB08的序列差異倍數(shù)為31.58，

4、與人15號染色體基因組序列有97％同源性，其對應(yīng)的基因仍需進一步分析；GenBankID為AI140221的序列與人母系表達基因(maternallyexpressedgene3，MEG3)mRNA之間的吻合度達97％；AI870661與巨噬細胞遷移抑制因子有95％的同源性。(2)對ADCAPE03電子拼接后的序列定位于11q13-14之間，與人轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中編號為DT.311034的序列有同源性，但是該序列仍無詳細的注解，無具體的基因

5、名稱，也無相應(yīng)的蛋白序列；ADCAPB08電子延伸后序列經(jīng)檢索Unigene數(shù)據(jù)庫，ADCAPB08選擇相似性蛋白是“SmallnuclearribonucleoproteinpolypeptideN(SNRPN)。(3)經(jīng)RT-PCR實驗驗證，SNRPN在有轉(zhuǎn)移的早期SCC中的表達均顯著高于其在無轉(zhuǎn)移的早期SCC中的表達(P＜0.01，P＜0.05)；而MEG3在無轉(zhuǎn)移的早期SCC中的表達顯著高于有轉(zhuǎn)移早期SCC宮頸癌組織(P＜0.0

6、1)。MIF的RT-PCR、IHC結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，其在早期SCC中的表達顯著高于在正常宮頸組織中的表達；且在有轉(zhuǎn)移的早期SCC中的表達高于在無轉(zhuǎn)移的早期SCC中的表達(P＜0.01，P＜0.05)；MIF蛋白在宮頸鱗癌SiHa細胞株的胞漿也有表達。 結(jié)論：發(fā)現(xiàn)與早期宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)的一個EST片段，序列號暫定為ADCAPE03；另外還第一次發(fā)現(xiàn)并檢測了SNRPN、MEG3、MIF在宮頸鱗癌中的表達。其中SNRPN的mRNA