運(yùn)用MLPA技術(shù)結(jié)合DNA-cDNA測(cè)序?qū)MD和SMA患者及高致病風(fēng)險(xiǎn)胎兒進(jìn)行基因診斷.pdf

1、目的：探討多重連接依賴探針擴(kuò)增（Multiple ligation-dependent probe amplification,MLPA）技術(shù)結(jié)合DNA和cDNA測(cè)序?qū)Χ攀霞I(yíng)養(yǎng)不良癥(duchenne muscular dystrophy，DMD)和脊髓性肌萎縮（Spinal muscular atrophy，SMA）患者及攜帶者基因檢測(cè)的臨床應(yīng)用價(jià)值，并在此基礎(chǔ)上研究MLPA技術(shù)對(duì)家系中高致病風(fēng)險(xiǎn)胎兒進(jìn)行產(chǎn)前基因診斷的臨床應(yīng)用，為進(jìn)

2、一步創(chuàng)建穩(wěn)定可靠的DMD和SMA產(chǎn)前診斷技術(shù)平臺(tái)奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：運(yùn)用MLPA技術(shù)對(duì)2008年2月至2010年4月來(lái)深圳市兒童醫(yī)院兒科研究所及我院就診的32個(gè)DMD家系中現(xiàn)存41例DMD患者、29例女性可能攜帶者、6例家系中健康男性成員、10例女性健康對(duì)照和10例男性健康對(duì)照共96人采集外周血提取基因組DNA，運(yùn)用MLPA技術(shù)對(duì)以上96人的DMD基因79個(gè)外顯子進(jìn)行分析；并于患者行病理活檢術(shù)時(shí)取右側(cè)腓腸肌10-30mg肌肉

3、組織提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA；根據(jù)研究需要選擇性進(jìn)行DNA及cDNA序列測(cè)定，驗(yàn)證MLPA檢測(cè)結(jié)果的可靠性；同期，對(duì)22例SMA患者及雙親39人，并選擇與患者無(wú)血緣關(guān)系、否認(rèn)遺傳病家族史的正常男性和女性對(duì)照各15人共91人進(jìn)行運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元生存基因（survival motor neuron gene，SMN）檢測(cè)，用聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)合限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)（Polymerase Chain Reaction restrictio

4、n fragment length polymorphism，PCR-RFLP）和DNA測(cè)序技術(shù)對(duì)MLPA檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。在此基礎(chǔ)上，對(duì)2個(gè)DMD和1個(gè)SMA產(chǎn)前診斷家系中具有高患病風(fēng)險(xiǎn)的3個(gè)胎兒于16-22孕周經(jīng)羊膜腔穿刺術(shù)抽取羊水，提取胎兒羊水DNA，采用MLPA技術(shù)并結(jié)合DNA測(cè)序技術(shù)對(duì)胎兒進(jìn)行產(chǎn)前基因診斷。
　　 結(jié)果：MLPA檢測(cè)32個(gè)DMD家系中現(xiàn)存41例患者，其中男性患者39例，女性患者2例。39例男性患者中外顯

5、子缺失27例（69.23％），外顯子重復(fù)3例（7.69％），余9例未檢測(cè)到外顯子缺失和重復(fù)（23.08％）。27例外顯子缺失的患者中有24例缺失范圍在外顯子42～55熱點(diǎn)區(qū)域，7例缺失范圍在外顯子9～22熱點(diǎn)區(qū)域，其中患者10和患者19～21其缺失外顯子范圍較大包含了以上的兩個(gè)突變熱點(diǎn)區(qū)域。2例女性患者M(jìn)LPA圖譜分別為外顯子47～50和外顯子35信號(hào)比正常女性明顯降低，似女性攜帶者，其突變外顯子信號(hào)峰值比正常對(duì)照顯著降低。結(jié)合其臨床表

6、現(xiàn)推測(cè)可能在另一條X染色體的DMD基因同時(shí)存在點(diǎn)突變。在外顯子缺失及重復(fù)家系中接受檢測(cè)的29例女性可能攜帶者中檢測(cè)出18例為外顯子缺失攜帶者，2例為外顯子重復(fù)攜帶者，其MLPA圖譜中外顯子峰信號(hào)降低及增高的位置與先證者外顯子缺失或重復(fù)位置一致；余9例未檢測(cè)到信號(hào)異常。對(duì)于4例外顯子缺失的患兒母親，未檢測(cè)到相應(yīng)外顯子信號(hào)異常，推測(cè)其患兒可能為新發(fā)突變。DMD產(chǎn)前診斷家系1中IV2女性胎兒，MLPA結(jié)果為DMD致病基因攜帶者。家系2中V3男

7、性胎兒MLPA結(jié)果顯示無(wú)DMD基因Exon43缺失，并經(jīng)羊水DNA測(cè)序結(jié)果證實(shí)了DMD基因Exon43存在，胎兒已出生，肌酶檢測(cè)及基因檢測(cè)均無(wú)異常。
　　 MLPA檢測(cè)22例SMA患者中16例為SMN1的外顯子7和外顯子8缺失純合子，6例為SMN1外顯子7缺失純合子；39名雙親的SMN1外顯子7的信號(hào)值均明顯比正常對(duì)照組平均信號(hào)值低30％～50％。PCR-RFLP和DNA測(cè)序技術(shù)支持MLPA有關(guān)SMN基因檢測(cè)結(jié)果。SMA產(chǎn)前診斷

8、家系先證者為SMN1外顯子7合并外顯子8缺失純合子，胎兒和先證者基因突變類型相同，患兒已引產(chǎn)，其臍帶血DNA檢測(cè)結(jié)果與羊水診斷結(jié)果一致。
　　 結(jié)論：MLPA技術(shù)能簡(jiǎn)便、快速、有效地檢測(cè)DMD和SMA所有外顯子的缺失與重復(fù)，結(jié)合DNA和cDNA測(cè)序技術(shù)能對(duì)患者及攜帶者進(jìn)行可靠的基因診斷，并在此基礎(chǔ)上對(duì)家系中具有高致病風(fēng)險(xiǎn)的胎兒進(jìn)行有效的產(chǎn)前基因診斷。MLPA技術(shù)結(jié)合DNA和cDNA測(cè)序在對(duì)DMD和SMA的基因診斷和產(chǎn)前基因診斷中