干預肥大心肌細胞代謝途徑的抗凋亡效應研究.pdf

1、大量的研究表明,心肌細胞凋亡是心肌肥厚向心力衰竭轉化的重要機制,在急性缺血再灌注的病理損傷機制中也起著重要的作用.目前,對細胞凋亡的生化過程和信號傳導途徑已基本闡明,即死亡受體和線粒體凋亡途徑,引發(fā)終極caspase級聯反應致細胞凋亡,線粒體調控細胞凋亡機制已被廣泛認同.心肌是能量代謝非常活躍的組織,線粒體的含量非常豐富.線粒體的主要功能是能量代謝,在心肌細胞生理功能中舉足輕重,但近年來發(fā)現,線粒體與細胞凋亡關系密切,具有凋亡調節(jié)功能.

2、線粒體代謝異常可表現為代謝途徑改變或電子傳遞受損,它們與凋亡的關系尚不清楚.心肌肥大時,能量代謝途徑發(fā)生了顯著改變,脂肪酸氧化顯著降低,而糖的利用明顯增加,相應地調控脂肪酸氧化的酶基因表達下降,出現胚胎時代謝模式.這種能量底物優(yōu)勢轉換的機制是多方面的,如慢性缺血缺氧、細胞內調節(jié)代謝途徑的相關因子的濃度和酶的磷酸化程度的改變等,起關鍵作用可能是PPARalpha/PGC-1復合體的失活,PPARalpha/PGC-1復合體是調節(jié)脂肪酸氧化

3、酶基因表達的主要因子.心肌肥大時,PPARalpha/PGC-1失活可能參與了能量底物轉換的多個水平上的調控,包括這些脂肪酸氧化酶基因表達下降和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)途徑產生的翻譯后效應.但導致PPARalpha/ PGC-1復合體的失活的機制目前欠清楚.近年來研究發(fā)現,心肌細胞能量代謝功能失衡與心肌肥大、心力衰竭有關,并且認為是由于線粒體電子傳遞體系異常生成大量

4、的氧自由基引起細胞凋亡.線粒體能量代謝依靠脂肪酸和糖氧化,二者相互調節(jié),各種中間產物代謝完全.但在缺血缺氧等條件下,容易出現代謝中間環(huán)節(jié)受阻,有害產物堆積.線粒體代謝途徑的改變可能與心肌細胞損傷有關.臨床上,應用活化糖代謝或抑制脂肪酸代謝的藥物,已收到了良好的心絞痛治療效果.但是,目前還不清楚是脂肪酸代謝活化誘導細胞凋亡,還是糖代謝有氧氧化活化抑制細胞凋亡作用,也不清楚活化糖代謝有氧氧化或抑制脂肪酸代謝的藥物能否抑制細胞凋亡,闡明這些問

5、題,對于指導我們在防治或延緩心肌肥大向心力衰竭轉化具有非常重要的意義.為了進一步探索心肌肥大時線粒體代謝途徑由脂肪酸氧化向糖代謝轉變以及肥大心肌缺血缺氧時脂肪酸氧化又突然活化這些代謝現象的發(fā)生機制,闡明線粒體代謝途徑改變與細胞凋亡的關系.該課題進行了體外培養(yǎng)并誘導心肌細胞肥大;肥大心肌細胞缺氧復氧的培養(yǎng);檢測肥大心肌細胞缺氧復氧時細胞凋亡及能量代謝的變化;激活或抑制糖代謝時,PDH、CPT活性及糖氧化率和脂肪酸代謝率;激活或抑制脂肪酸代

6、謝時,PDH、CPT活性及糖氧化率和脂肪酸代謝率.方法:用組織胰蛋白酶消化法分離、培養(yǎng)2-3d Wistar大鼠心肌細胞.無血清的培養(yǎng)基中加入0.1μmol/L AngⅡ+1μmol/L NE 培養(yǎng)12h,誘導心肌細胞肥大并通過測定細胞的表面積、蛋白質的含量及[<'3>H]-Leu摻入量三種方法來鑒定.肥大心肌細胞在有血清的培養(yǎng)基中持續(xù)給95﹪N<,2>和5﹪CO<,2> ,控制氧分壓在5mmHg以下缺氧培養(yǎng)8h后,恢復給氧(20﹪O<

7、,2>,5﹪CO<,2>)培養(yǎng).在此基礎上,分別在復氧后0,4,8,12h進行以下檢測:① 用TUNEL法檢測細胞的凋亡,取5個高倍視野(400倍),記數200個細胞中的陽性細胞數,計算出凋亡細胞率;② PDH活性測定:丙酮酸底物摻入心肌細胞代謝產生乙酰CoA,乙酰CoA與<'14>C-草酰乙酸生成<'14>C枸櫞酸,用液體閃爍儀定量生成的乙酰CoA來反映PDH活性;③ CPT活性測定: <'3>H-肉堿底物、軟脂酸與提取的心肌細胞線粒

8、體溫育,含<'14>C產物用液體閃爍儀定量.④ 糖氧化測定:[U-<'14>C]-D-葡萄糖與細胞溫育1h,收集<'14>CO<,2>,液閃測定.⑤脂肪酸氧化測定:Na[1-<'14>C]軟脂酸與細胞溫育1h,收集14CO<,2>,液閃測定.干預實驗:肥大的心肌細胞缺氧培養(yǎng)8h后,換無血清培養(yǎng)基有氧培養(yǎng),同時加入干預試劑,分100 ,1000,10 000 μmol/L DCA、 0.1,1,10 μmol/L Antimycin A、

9、0.1 ,1,10 μmol/L TMZ和20,40,80 μmol/L L-carnitine幾組,各自分別在8h測定每組PDH和CPT活性、糖氧化率、脂肪酸代謝率; 復氧時加1000 μmol/L DCA、1 μmol/L Antimycin A、5 μmol/L TMZ和40μmol/L L-carnitine分別在0,4,8,12h測定各自PDH活性、CPT活性、糖氧化率、脂肪酸代謝率.結果:1. 心肌細胞肥大的誘導和鑒定:在加

10、入Ang Ⅱ+NE培養(yǎng)12h培養(yǎng)后,心肌細胞蛋白質含量增加70.4﹪,心肌細胞表面積明顯增加(49.7﹪);[<'3>H]-Leu摻入量顯著提高 (115.2﹪),心肌細胞發(fā)生了肥大.2. 缺氧復氧條件下心肌細胞凋亡率和線粒體代謝:肥大心肌細胞缺氧8h后凋亡率為10.4﹪左右,而非肥大心肌細胞凋亡率為8.3﹪,但隨著有氧環(huán)境的恢復,肥大心肌細胞凋亡加速,12h后凋亡率達到22.8﹪以上,明顯高于對照組(P<0.05).表明缺氧復氧對肥大

11、心肌細胞比正常心肌更容易引起凋亡.3. 缺氧復氧條件下線粒體代謝:缺氧時,PDHa活性降低(P<0.05),PDHt變化不是很明顯(P>0.05),PDHa/PDHt明顯降低(P<0.05);心肌細胞糖氧化下降48﹪;CPT活性降低(P<0.05),脂肪酸氧化下降60﹪.復氧時,PDHa、PDHa/PDHt、CPT逐漸恢復到缺氧前的水平, 8h后糖氧化、脂肪酸氧化基本回到缺氧前的水平(P>0.05).4. 干預實驗:加入100 μmol

12、/L—10 000 μmol/LDCA后, PDHa活性較對照組增強(P<0.05), PDHa/PDHt比值上升,且呈現量效關系;PDHt與對照組相比改變不明顯(P>0.05),糖氧化增強, CPT活性和脂肪酸的氧化下降(P<0.05).相反地,Antimycin A在濃度0.1 μmol/L-10 μmol/L時抑制PDHa活性和糖氧化,在1 μmol/L-10 μmol/L增強CPT活性和脂肪酸氧化.1 μmol/L-10 μmo

13、l/L TMZ 增加PDHa活性和PDHa/PDHt比值(P<0.05或P<0.01),提高糖氧化,抑制脂肪酸氧化,對CPT活性無明顯影響(P>0.05).L-carnitine在濃度40-80 μmol/L增加PDHa活性和提高PDHa/PDHt比值,對糖氧化無明顯影響(P>0.05),增強CPT活性,提高脂肪酸氧化(P<0.05或P<0.01).1 000 μmol/L DCA、1 μmol/L Antimycin A、5 μmol

14、/L TMZ和40 μmol/L L-carnitine各自對肥大心肌細胞PDH活性、CPT活性、糖氧化、脂肪酸氧化作用無明顯的時-效關系.結論:1. 我們通過測定細胞表面積、細胞蛋白含量、細胞蛋白合成速率三種方法證實了Ang Ⅱ+NE能誘導原代培養(yǎng)心肌細胞肥大,這是體外培養(yǎng)肥大心肌細胞簡便和實用的模型.2. 在缺氧復氧的條件下,肥大心肌細胞比正常心肌細胞更容易發(fā)生凋亡.3. 缺氧時肥大心肌細胞的糖氧化和脂肪酸氧化下降,復氧后,二者均能