免骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞片(MSCs)包裹新型rhBMP-2-硫酸鈣支架修復(fù)兔大段尺骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景:
　　 隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)和交通的高速發(fā)展,高能量的各種車禍傷創(chuàng)傷等所導(dǎo)致的骨缺損越來(lái)越多;以及骨組織感染、腫瘤切除和發(fā)育異常等疾病等導(dǎo)致的骨缺損發(fā)病率也在增高。這不僅給患者和社會(huì)帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān),而且也嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量,是臨床治療的難題。目前,臨床多采用新鮮自體骨移植治療,但由于骨來(lái)源的限制、二次損傷及治療相關(guān)并發(fā)癥等問(wèn)題,限制了該方法的廣泛應(yīng)用。因此,研究新的治療策略已十分必要。最近,組織工程技術(shù)的發(fā)展為治療大段

2、骨缺損提出了新的思路,即將活細(xì)胞體外培養(yǎng)擴(kuò)增后接種于某些特殊支架材料上,以構(gòu)建生物人工組織,植入受體后在局部微環(huán)境的作用下發(fā)揮細(xì)胞的成骨效應(yīng)。
　　 目的:
　　 研究復(fù)合重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(rhBMP-2)硫酸鈣支架體外對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化的影響;其次,在體內(nèi),研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)包裹的復(fù)合重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(rhBMP-2)硫酸鈣人工骨支架修復(fù)兔長(zhǎng)骨骨缺損的作用與效果。
　　 方法:

3、
　　 1.兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離與培養(yǎng):8周齡雄性新西蘭大白兔15只,每只動(dòng)物均行雙側(cè)髂骨骨髓穿刺抽取骨髓,體外密度梯度離心法聯(lián)合細(xì)胞貼壁法分離培養(yǎng)擴(kuò)增新西蘭兔MSCs。2.支架對(duì)MSCs的成骨分化:將材料做成直徑6mm,厚度2mm的圓盤狀,放在培養(yǎng)板中,種上密度為5000個(gè)/cm2的細(xì)胞,常規(guī)進(jìn)行貼壁培養(yǎng)7天、14天后對(duì)細(xì)胞的堿性磷酸酶含量進(jìn)行測(cè)定。3.干細(xì)胞片的制作:將密度為50000個(gè)/cm2的細(xì)胞懸液用培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)

4、2-3周,直至形成細(xì)胞薄片。將細(xì)胞片包裹在硫酸鈣支架上備有。4.兔骨缺損修復(fù):選用20只新西蘭大白兔,制成單側(cè)前肢15mm的尺骨骨缺損模型,隨機(jī)分為四組:A組植入單純硫酸鈣支架;B組植入復(fù)合重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(rhBMP-2)硫酸鈣支架;C組植入經(jīng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)包裹的硫酸鈣支架;D組植入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)包裹的復(fù)合重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(rhBMP-2)硫酸鈣支架。在術(shù)后4周隨機(jī)處死動(dòng)物,作下列檢測(cè):大體

5、觀察、X線檢查、microCT、組織學(xué)檢測(cè)、X線片的計(jì)算機(jī)圖像分析、microCT的骨量分析、組織切片的計(jì)算機(jī)圖像分析并對(duì)以上結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 結(jié)果:
　　 1.體外7天測(cè)得堿性磷酸酶含量(nmol/s/mg蛋白)為:rhBMP-2-硫酸鈣支架組含量為0.51±0.08,比單純的硫酸鈣組(含量為:0.30±0.03)明顯升高(p＜0.05);在14天時(shí),堿性磷酸酶含量rhBMP-2-硫酸鈣支架組(1.22±0.

6、21)明顯高于單純硫酸鈣組(0.42±0.04),P＜0.05;但是,在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)上無(wú)論是rhBMP-2-硫酸鈣支架組還是單純硫酸鈣支架組的堿性磷酸酶含量都明顯高于單純培養(yǎng)瓶組(P＜0.05)。
　　 2.標(biāo)本大體觀察:A組缺損大部分由纖維組織連接;B組與C組大體上區(qū)別不大,兩組的缺損外緣和中間有很多纖維組織,緊靠撓骨處和兩個(gè)斷端周圍都有一定量的骨組織存在;D組缺損幾乎都被大量骨組織替代;3.X線檢查示:B組與C組無(wú)明顯差別,但

7、是都優(yōu)于A組(p＜0.05);D組優(yōu)于B組和C組(P＜0.05)。X線評(píng)分所示:D組＞B組≈C組＞A組。4.microCT與骨量分析:在四周后,各組硫酸鈣大部分都已經(jīng)吸收,A組骨組織非常有限;而B組和C組CT掃描顯示有大量骨痂生成,但是在缺損中心以及遠(yuǎn)離撓骨一側(cè)的缺損處骨量很少,并且髓腔結(jié)構(gòu)不明顯;在D組,大量骨痂形成,并且骨缺損已經(jīng)成骨性愈合,可見(jiàn)大部分髓腔陰影。CT骨量分析示:B組與C組無(wú)明顯差別,但是都優(yōu)于A組(p＜0.05);D

8、組優(yōu)于B組和C組(P＜0.05)。5.組織學(xué)切片與組織學(xué)半定量:組織切片結(jié)果與microCT相似,組織半定量也顯示B組與C組無(wú)明顯差別,但是都優(yōu)于A組(p＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.證明硫酸鈣支架是生長(zhǎng)因子rhBMP-2的良好載體,并可以作為間充質(zhì)干細(xì)胞片附著的良好支架。2.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞片的移植可以有效地促進(jìn)新骨的生成及骨缺損的愈合。3.rhBMP-2復(fù)合硫酸鈣誘導(dǎo)成骨的作用也非常明顯。4.結(jié)論也說(shuō)明MS