TH-GDNF基因修飾的胚胎干細(xì)胞治療帕金森病模型大鼠的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一種常見(jiàn)于中老年人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，其主要病理學(xué)改變是黑質(zhì)多巴胺(dopamine，DA)能神經(jīng)元變性壞死，紋狀體內(nèi)DA能神經(jīng)遞質(zhì)匱乏。PD的發(fā)病機(jī)制目前仍不清楚，因此至今尚無(wú)滿意的治療方法。理想的PD治療方法應(yīng)該不僅能糾正腦內(nèi)DA含量的不足，還要保護(hù)殘存的DA能神經(jīng)元。目前認(rèn)為，干細(xì)胞移植結(jié)合基因治療可能是實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的最佳途徑之一。胚胎干(embryonic stem，

2、ES)細(xì)胞因具有在體外無(wú)限或較長(zhǎng)期增殖和多向分化潛能而成為早期胚胎發(fā)育研究和細(xì)胞治療的良好來(lái)源。傳統(tǒng)的PD基因治療主要有兩條途徑：通過(guò)將促進(jìn)DA合成的相應(yīng)酶基因如酪氨酸羥化酶(tyrosinehydroxylase，TH)引入紋狀體，以提高紋狀體內(nèi)DA含量；或者通過(guò)將神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子基因如膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(glial cell line derived neurotrophic factor，GDNF)引入黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)，阻止DA能

3、神經(jīng)元凋亡，維持其存活和促進(jìn)其功能修復(fù)，使受損的DA能神經(jīng)元有可能重建和恢復(fù)功能。若同時(shí)給予GDNF基因和TH基因，可能達(dá)到防治兼?zhèn)涞哪康?，?yīng)該是目前PD基因治療的理想策略。 本研究采用了分子克隆、細(xì)胞培養(yǎng)和基因轉(zhuǎn)染等研究方法，分別將小鼠GDNF基因和人源性TH基因克隆到真核表達(dá)質(zhì)粒載體plRES的上下游，構(gòu)建出pIRES-TH-GDNF。將此功能載體轉(zhuǎn)染分化的大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞(differentiated PC12，d

4、PC12)，檢測(cè)了轉(zhuǎn)染該基因的dPC12拮抗MPP<'+>損傷的作用。然后將此功能載體pIRES-TH-GDNF轉(zhuǎn)染小鼠ES細(xì)胞，并將攜帶TH和GDNF基因的ES(TH-GDNF-ES)細(xì)胞和ES細(xì)胞分別植入6-羥基多巴胺(6-hydoxydopamine，6-OHIDA)損傷的PD模型大鼠紋狀體、黑質(zhì)和同時(shí)植入黑質(zhì)及紋狀體(雙移植)。通過(guò)觀察大鼠行為學(xué)改變和移植細(xì)胞分化成TH陽(yáng)性神經(jīng)元的情況，以了解ES細(xì)胞或TH-GDNF-ES細(xì)胞對(duì)

5、PD大鼠的治療作用。并將逆行追蹤劑熒光金(Fluo-Gold，F(xiàn)G)注射入損毀側(cè)紋狀體，觀察DA神經(jīng)通路的重建，以尋找PD細(xì)胞移植及基因治療的最佳途徑。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： 1、構(gòu)建了雙基因表達(dá)的plRES-TH-GDNF載體，酶切鑒定及測(cè)序結(jié)果證實(shí)其是正確的。 2、將pIRES-TH-GDNF轉(zhuǎn)染dPC12和ES細(xì)胞，經(jīng)G418篩選后，得到了穩(wěn)定表達(dá)TH和GDNF的dPC12和ES細(xì)胞。用RT-PCR和細(xì)胞免疫熒光

6、等方法能檢測(cè)出TH和GDNF在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。 3、MTT。法檢測(cè)細(xì)胞存活率顯示：未轉(zhuǎn)染pIRES-TlH-GDNF的dPC12細(xì)胞在25 μ M的MPP<'+>作用下，細(xì)胞存活率明顯下降；而轉(zhuǎn)染TH-GDNF基因的細(xì)胞在100 μ M濃度的MPP<'+>作用下，細(xì)胞存活率才出現(xiàn)明顯下降(P<0.05)，表明轉(zhuǎn)染后的dPC12能很好的對(duì)抗MPP<'+>毒性作用。 4、免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：ES細(xì)胞及TH-GDNF-ES

7、細(xì)胞植入6-OHDA損傷側(cè)的紋狀體及黑質(zhì)后細(xì)胞存活狀態(tài)較好，部分細(xì)胞分化為T(mén)H陽(yáng)性神經(jīng)元。與ES細(xì)胞移植組相比，TH-GDNF-ES細(xì)胞移植組生成的TH陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目明顯增多(P<0.05)。 5、行為檢測(cè)結(jié)果顯示：移植后4～8w，ES細(xì)胞移植(紋狀體、黑質(zhì)、紋狀體+黑質(zhì))組及TH-GDNF-ES細(xì)胞移植(黑質(zhì))組PD大鼠的旋轉(zhuǎn)行為與對(duì)照組相比無(wú)明顯改善(P>0.05)。而TH-GDNF-ES細(xì)胞移植(紋狀體、紋狀體+黑質(zhì))組P

8、D大鼠的旋轉(zhuǎn)行為與對(duì)照組相比明顯改善(P<0.05)，但TH-GDNF-ES細(xì)胞移植(紋狀體)組與TH-GDNF-ES細(xì)胞移植(紋狀體+黑質(zhì))組相比差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 6、HPLC檢測(cè)結(jié)果顯示，移植后8w，與對(duì)照組相比，ES細(xì)胞移植(紋狀體、黑質(zhì)、紋狀體+黑質(zhì))組及TH-GDNF-ES細(xì)胞移植(黑質(zhì))組PD大鼠紋狀體內(nèi)DA及其代謝產(chǎn)物3,4二羥基苯乙酸(3,4-dihydroxyphenylacetic acid

9、，DOPAC)含量無(wú)明顯增高(P>0.05)。而TH-GDNF-ES細(xì)胞移植(紋狀體、紋狀體+黑質(zhì))組PD大鼠紋狀體內(nèi)DA及DOPAC含量明顯增高(P<0.05)。但TH-GDNF-ES細(xì)胞移植(紋狀體)組與TH-GDNF-ES細(xì)胞移植(紋狀體+黑質(zhì))組相差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 7、FG注射紋狀體2w后，在TH-GDNF-ES細(xì)胞移植(紋狀體+黑質(zhì))組PD大鼠同側(cè)的黑質(zhì)中觀察到有FG逆行標(biāo)記的TH陽(yáng)性神經(jīng)元。

10、 上述結(jié)果表明，我們成功構(gòu)建了雙基因表達(dá)的pIRES-TH-GDNF載體，其攜帶的功能基因(TH和GDNF)導(dǎo)入到dPC12和ES細(xì)胞內(nèi)，隨細(xì)胞分裂而進(jìn)入子代細(xì)胞并能高效表達(dá)，且在dPC12細(xì)胞內(nèi)起到對(duì)抗MPP<'+>毒性的作用；ES細(xì)胞及TH-GDNF-ES細(xì)胞移植到6-OHDA制備的PD大鼠紋狀體及黑質(zhì)后細(xì)胞存活狀態(tài)較好，并分化成TH陽(yáng)性神經(jīng)元；TH-GDNF-ES細(xì)胞移植(紋狀體、紋狀體+黑質(zhì))可增加PD大鼠紋狀體的DA及DOP