HPSE-1和VEGF的相互上調(diào)-一種觸發(fā)惡性黑素瘤進(jìn)展的新型機(jī)制.pdf

1、惡性黑素瘤（Malignantmelanoma，MM），作為來源于黑素細(xì)胞（Melanocyte，MC）的惡性腫瘤，是目前侵襲性最強(qiáng)、致死率最高的皮膚惡性疾病。轉(zhuǎn)移性MM更是對所有的治療策略都存在耐受，預(yù)后極差，5年生存率低，對人類造成了極大的危害。但是，MM如何進(jìn)展為一種高度攻擊性疾病的相關(guān)機(jī)制卻仍被人們知之甚少。
　　乙酰肝素酶（Heparanase，HPSE-1），一種哺乳動(dòng)物的β-葡萄糖醛酸內(nèi)切酶，在多種惡性腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)

2、移、預(yù)后和低生存率中扮演著重要的角色。HPSE-1由于具有酶解基底膜（Basementmembrane，BM）和細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellularmatrix，ECM）的主要成分——硫酸乙酰肝素多糖鏈（Heparansulfateproteoglycans，HSPGs）的活性，參與ECM的降解和重塑，因此HPSE-1表達(dá)的升高與腫瘤進(jìn)展的關(guān)系非常密切，反之，下調(diào)HPSE-1的表達(dá)已成為惡性腫瘤的有效治療策略。雖然，HPSE-1在腫瘤

3、中的研究已取得很大的進(jìn)展，但HPSE-1促進(jìn)腫瘤發(fā)展的機(jī)制尚有很多問題亟待探討。
　　許多證據(jù)表明，HPSE-1與諸多生長因子的關(guān)系密切，很可能與腫瘤進(jìn)展相關(guān)。HPSE-1主要通過其胞外的酶解活性和參與胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)節(jié)生長因子的表達(dá)和活性。而在生長因子中，血管內(nèi)皮生長因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF），作為一個(gè)與血管形成密切相關(guān)的關(guān)鍵因子，是腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移所必需的。因此，我們做出如下

4、推測：HPSE-1一方面可降解HSPGs從而釋放在ECM寄居的VEGF，另一方面，HPSE-1可通過參與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)來誘導(dǎo)VEGF的表達(dá)；繼而VEGF的釋放和表達(dá)增高可促使與受體的結(jié)合，從而啟動(dòng)相關(guān)信號途徑，這些途徑的激活可上調(diào)與細(xì)胞增生、存活、侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)的核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，而在這些因子中，其中有部分可通過結(jié)合HPSE-1的啟動(dòng)子而調(diào)節(jié)HPSE-1的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。據(jù)此，VEGF在腫瘤中極可能具有尚未被發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)HPSE-1表達(dá)的功能。

5、r>　　根據(jù)以上的論述，我們假設(shè)HPSE-1和VEGF在MM中存在雙向相互上調(diào)關(guān)系，而此關(guān)系作為一種新型機(jī)制很可能在MM的進(jìn)展中起著決定性的作用。本研究的目的在于證實(shí)HPSE-1和VEGF的相互上調(diào)關(guān)系存在于MM，并闡明此種關(guān)系對MM細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為所產(chǎn)生的效應(yīng)和影響，為進(jìn)一步揭示MM的發(fā)病機(jī)制、拓寬MM的治療策略提供新的思路和理念。
　　實(shí)驗(yàn)一 HPSE-1和VEGF在MM細(xì)胞存在雙向上調(diào)關(guān)系方法和結(jié)果：
　?、佥d體構(gòu)

6、建和鑒定：經(jīng)酶切和測序鑒定，成功構(gòu)建了HPSE-1的SiRNA表達(dá)載體；
　　②細(xì)胞的轉(zhuǎn)染和目的基因表達(dá)的鑒定：成功篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HPSE-1表達(dá)載體和VEGF表達(dá)載體的A2058細(xì)胞系，并經(jīng)鑒定，各轉(zhuǎn)染目的基因的表達(dá)在mRNA和蛋白水平均有顯著的升高，而瞬時(shí)轉(zhuǎn)染二者SiRNA載體的細(xì)胞，也顯示了對目的基因的明顯抑制效應(yīng)；
　　③HPSE-1對VEGF表達(dá)的調(diào)控：當(dāng)上調(diào)HPSE-1的表達(dá)時(shí)，VEGF的熒光定量PCR、West

7、ern-blot及ELISA結(jié)果均顯示，VEGF的表達(dá)水平隨之升高；而抑制HPSE-1的表達(dá)時(shí)，VEGF的表達(dá)水平隨之降低，說明HPSE-1可調(diào)節(jié)VEGF的表達(dá)；
　　④VEGF對HPSE-1表達(dá)的調(diào)控：當(dāng)通過表達(dá)載體、SiRNA的轉(zhuǎn)染以及外源性VEGF的加入來調(diào)控VEGF后，HPSE-1的表達(dá)水平無論在mRNA還是蛋白水平均出現(xiàn)相應(yīng)的變化，提示VEGF反過來也可調(diào)節(jié)HPSE-1的表達(dá)；
　?、軵D98059對二者相互上調(diào)關(guān)

8、系的影響：應(yīng)用MEK/ERK的特異性抑制劑——PD98059分別作用于表達(dá)HPSE-1和VEGF的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，HPSE-1和VEGF的相互上調(diào)均出現(xiàn)不完全的阻滯，同時(shí)MEK/ERK信號通路的激活狀態(tài)也得到抑制。
　　結(jié)論：
　　首次體外發(fā)現(xiàn)MM細(xì)胞中HPSE-1和VEGF存在雙向上調(diào)關(guān)系，而這種雙向上調(diào)可被MEK/ERK信號通路的抑制劑PD98059不完全的阻滯。
　　實(shí)驗(yàn)二 HPSE-1與VEGF的雙向上調(diào)關(guān)系對

9、
　　MM細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為的影響
　　方法和結(jié)果：
　　①細(xì)胞增殖活性檢測：MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)HPSE-1和VEGF的轉(zhuǎn)染可提高A2058細(xì)胞的增殖能力，而PD98059對此有抑制效應(yīng)；
　?、诩?xì)胞侵襲力檢測：Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與MTT的結(jié)果基本一致，HPSE-1和VEGF的轉(zhuǎn)染細(xì)胞組透過微孔膜細(xì)胞數(shù)明顯高于對照組，但可被PD98059阻滯；
　?、勐闶蟪闪鰧?shí)驗(yàn)：將各組腫瘤組織稱重，結(jié)果顯

10、示HPSE-1和VEGF的轉(zhuǎn)染細(xì)胞組，分別給予VEGF的中和單抗——Avastin干預(yù)后，其腫瘤重量均明顯減??；
　?、芰鼋M織形態(tài)學(xué)觀察：轉(zhuǎn)染HPSE-1細(xì)胞組的瘤組織行HE染色，發(fā)現(xiàn)未加入Avastin組細(xì)胞生長狀態(tài)較好，瘤體中間有微血管形成，而加入Avastin組，腫瘤細(xì)胞壞死明顯，瘤體內(nèi)可見片狀壞死區(qū)，說明HPSE-1所誘導(dǎo)產(chǎn)生的VEGF被Avastin中和，腫瘤血管生成障礙；
　?、萘鼋M織HPSE-1的mRNA水平檢

11、測：轉(zhuǎn)染VEGF的A2058細(xì)胞接種裸鼠體內(nèi)，在給予Avastin后，中和VEGF的同時(shí)，降低了HPSE-1的mRNA水平，說明在體VEGF對HPSE-1的表達(dá)仍然具有調(diào)控作用。
　　結(jié)論：
　　體內(nèi)和體外研究均發(fā)現(xiàn)HPSE-1和VEGF的雙向上調(diào)可促進(jìn)MM細(xì)胞增殖、侵襲和生長速度；體外應(yīng)用PD98059或體內(nèi)應(yīng)用Avastin，即打斷二者的相互聯(lián)系，可降低和抑制HPSE-1和VEGF的相互上調(diào)所賦予MM細(xì)胞的高度增殖、侵襲