乳腺癌MCF-7和乳腺病變的干細胞分化及其神經(jīng)內(nèi)分泌分化的研究.pdf

1、研究背景和目的：干細胞的研究推動了病理學(xué)及腫瘤學(xué)的發(fā)展。人們開始認識到腫瘤是一種干細胞疾病。就乳腺腫瘤性疾病而言，已有研究證明，乳腺上皮干細胞的存在。由于干細胞具有自我更新和多向分化潛能，處于增殖狀態(tài)的細胞易受致癌物的攻擊發(fā)生突變，同時干細胞是唯一能長期生存并保持增殖能力的細胞，它們有更多的突變機會，所以乳腺病變是干細胞接受兩次或多次突變打擊而形成的。 目前還沒有一個明確的乳腺上皮干細胞標(biāo)記物的指標(biāo)，近年來，利用Hoechst3

2、3342染色不著色或弱著色，經(jīng)流式細胞儀篩選，有一群數(shù)量很少的位于邊緣的細胞，叫做(side population)SP細胞。研究證明SP細胞具有干細胞的特點，可以自我更新，增殖和分化。SP表型被認為是很好的分選干細胞的方法，而SP細胞表型的產(chǎn)生與乳腺癌耐藥蛋白(BreastCancer resistance protein，BCRP)有關(guān)，所以有學(xué)者認為BCRP是潛在的干細胞標(biāo)記物。 乳腺癌伴神經(jīng)內(nèi)分泌分化是乳腺癌的一個特殊類

3、型，正常乳腺組織是否存在神經(jīng)內(nèi)分泌細胞尚存在爭議，但絕大多數(shù)研究者認為正常乳腺組織中沒有神經(jīng)內(nèi)分泌細胞，乳腺癌中出現(xiàn)神經(jīng)內(nèi)分泌細胞是乳腺上皮干細胞在分化過程中受局部微環(huán)境和激素水平的影響發(fā)生突變，而產(chǎn)生了異常分化的結(jié)果。所以從干細胞多向分化的角度對乳腺癌伴神經(jīng)內(nèi)分泌分化進行研究，有利于對乳腺干細胞分化進行深入探討。 目前，BCRP在國內(nèi)外是熱點研究課題之一，我們從基因和蛋白水平檢測BCRP在乳腺上皮良、惡性增生病變中的表達，用C

4、K8、CgA標(biāo)記乳腺分化細胞，來探討乳腺上皮干/祖細胞分化及其演變規(guī)律，為揭示乳腺病變的發(fā)生及分化特點提供新的思路。 方法： 1．采用免疫細胞化學(xué)方法檢測BCRP在乳腺癌細胞系MCF-7的表達情況。 2.乳腺癌細胞系MCF-7經(jīng)熒光染料Hoechst33 342染色，熒光顯微鏡下觀察SP干細胞泵出染料的功能，計數(shù)SP細胞比例，及其與MCF-7細胞表達BCRP的關(guān)系。 3.采用雙免疫熒光染色方法檢測CK8、

5、CgA在乳腺癌細胞系MCF-7的表達情況。 4.采用免疫組化S-P法分別檢測13例正常乳腺組織、16例乳腺增生癥、12 例非典型增生組織和48例乳腺腫瘤中BCRP的表達情況，探討B(tài)CRP在乳腺各組織中的表達及與分化的關(guān)系。 5.采用RT-PCR方法檢測BCRP的mRNA在乳腺良、惡性增生疾病和癌旁組織中的表達情況。 6.采用免疫組化S-P法分別檢測13例正常乳腺組織、16例乳腺增生癥、12例非典型增生組織和48例

6、乳腺癌中CK8、CgA的表達情況，并對它們在乳腺良、惡性增生組織類型、分化程度上的差異以及它們各自之間的相關(guān)性進行觀察總結(jié)。 結(jié)果： 1.乳腺癌細胞系MCF-7中BCRP的陽性表達與SP細胞計數(shù)存在顯著相關(guān)性，PERSON相關(guān)分析，P<0.01。 2.雙免疫熒光染色檢測MCF-7中有CK8與CgA共表達的細胞。 3.BCRP在乳腺正常組織、增生、非典型增生、浸潤癌組織中的表達逐漸增多，在正常組織和增生組織

7、中的表達與浸潤癌組織中的表達存在差異，P<0.05；檢測BCRPmRNA的表達，乳腺癌組織中的陽性表達率、表達水平均顯著高于癌旁組織和增生組織，P<0.01。 4.CgA在乳腺正常組織和增生組織中均未見表達，在48例乳腺癌組織中有8例表達，表達率為16.7﹪；CK8在正常乳腺組織和乳腺增生病中全部表達，在12例非典型增生中有9例表達，陽性率為75﹪，48例乳腺癌中32例表達，陽性率為66.7﹪，其中6例原位癌4例表達，42例浸潤

8、癌28例表達，各病變之間的表達有明顯差異(P=0.01)。 結(jié)論： 1.MCF-7中有SP細胞，BCRP與SP表型的產(chǎn)生有關(guān)。 2.在MCF-7細胞免疫熒光雙重染色中可見CK8和CgA共表達的現(xiàn)象，提示MCF-7中存在多向分化能力的干細胞。 3.CK8作為腺腔上皮的標(biāo)記物在正常乳腺組織和乳腺增生病中全部表達，在非典型增生表達下降，在乳腺癌組織中的表達減少。各組間的表達存在差異。CgA在乳腺正常組織和增生組

9、織中都沒有表達，在原位癌中出現(xiàn)表達，在浸潤癌中增多，說明乳腺上皮干細胞在向惡性程度逐漸轉(zhuǎn)化過程中，細胞向腺腔上皮方向分化減弱，分化不成熟，分化程度下降，同時有部分細胞向神經(jīng)內(nèi)分泌方向分化。 4．BCRP在正常乳腺組織、增生組織和癌組織中表達呈逐漸增多趨勢，即分化程度越低，表達越多，BCRPmRNA檢測與BCRP蛋白檢測結(jié)果一致。BCRP與CgA、CK．8的表達陽性率相關(guān)性分析顯示，BCRP與CgA的表達強相關(guān)，這些均提示BCRP