MiR-146a對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化免疫炎癥的影響及普羅布考-瑞舒伐他汀的干預(yù)作用.pdf

1、背景：動(dòng)脈粥樣硬化(AS)是一種涉及免疫和炎癥反應(yīng)的復(fù)雜的慢性炎性疾病。MicroRNA-146（miR-146）是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)在免疫系統(tǒng)中具有調(diào)節(jié)作用的microRNA(miRNA)，包括miR-146a和miR-146b兩種形式。近年研究表明，miR-146a在AS斑塊中高度表達(dá)，表明miR-146a和AS密切相關(guān)。TOLL樣受體4(TLR4)是一種介導(dǎo)天然免疫反應(yīng)的跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受體，通過(guò)激活核因子-κB(NF-κB)啟動(dòng)炎癥反應(yīng)，

2、參與了AS的形成、進(jìn)展以及斑塊破裂的各個(gè)環(huán)節(jié)，可通過(guò)多途徑影響AS進(jìn)程。普羅布考和瑞舒伐他汀是治療AS的常用藥物。近年研究表明，二者除調(diào)脂作用外，還具有其它獨(dú)立于調(diào)脂外的多效性作用。但miR-146a在AS炎癥TLR4/NF-κB信號(hào)通路中的調(diào)控作用及普羅布考、瑞舒伐他汀對(duì)于miR-146a的影響還不清楚。
　　 目的：探討miR-146a是否通過(guò)其靶基因TNF受體相關(guān)因子6(TRAF6)調(diào)控AS中TLR4/NF-κB信號(hào)通路，

3、以及普羅布考/瑞舒伐他汀是否通過(guò)調(diào)控miR-146a，通過(guò)免疫炎癥調(diào)節(jié)起到抗AS作用。
　　 方法：⑴體外培養(yǎng)人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞（human acute monocyticleukemia cell，人THP-1單核細(xì)胞），給予脂多糖(LPS)(1μg/ml)刺激構(gòu)建細(xì)胞炎癥損傷模型，分為6組：對(duì)照組:不加任何干預(yù)因素；)模型組:LPS；miR-146a mimic組:轉(zhuǎn)染miR-146a mimic+LP；miR-146

4、a inhibitor組:轉(zhuǎn)染miR-146a inhibitor+LPS；miR-146a mimic陰性對(duì)照組:轉(zhuǎn)染miR-146amimic陰性對(duì)照+LPS；miR-146a inhibitor陰性對(duì)照組:轉(zhuǎn)染miR-146ainhibitor陰性對(duì)照+LPS。應(yīng)用RT-PCR法測(cè)定miR-146a、TLR4、髓樣分化因子88(MyD88)、TRAF6、NF-κB mRNA表達(dá)，Western blot法測(cè)定TRAF6、NF-κB

5、蛋白表達(dá)，酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測(cè)細(xì)胞上清液白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平。⑵體外培養(yǎng)人THP-1單核細(xì)胞，給予LPS(1μg/ml)刺激，并給予藥物干預(yù)，分為5組：對(duì)照組:無(wú)水乙醇+二甲基亞楓(DMSO)；模型組:LPS+無(wú)水乙醇+DMSO；普羅布考組:LPS+無(wú)水乙醇+DMSO+普羅布考；瑞舒伐他汀組:LPS+無(wú)水乙醇+DMSO+瑞舒伐他??；聯(lián)合組:LPS+無(wú)水乙醇+DMSO+普羅布考+瑞舒伐他汀

6、。應(yīng)用RT-PCR法測(cè)定miR-146a、TLR4、MyD88、TRAF6、NF-κB mRNA表達(dá)，Western blot法測(cè)定TRAF6、NF-κB蛋白表達(dá)，ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清液IL-6、TNF-α水平。⑶高脂飼料喂養(yǎng)載脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠，構(gòu)建AS模型，分為5組：對(duì)照組:野生型C57BL/6J小鼠，普通飲食；模型組:ApoE-/-小鼠，高脂飲食；普羅布考組:模型組基礎(chǔ)上給予普羅布考飼料；瑞舒伐他汀組:模型組

7、基礎(chǔ)上給予瑞舒伐他汀灌胃；聯(lián)合組:模型組基礎(chǔ)上給予普羅布考飼料+瑞舒伐他汀灌胃。喂養(yǎng)12周后，心臟穿刺取血檢測(cè)血脂及載脂蛋白水平，處死小鼠后取主動(dòng)脈標(biāo)本，RT-PCR法檢測(cè)AS斑塊miR-146a、TLR4、TRAF6、NF-κB mRNA表達(dá)，Western blot法檢測(cè)AS斑塊TRAF6、NF-κB蛋白含量。
　　 結(jié)果：①LPS刺激人THP-1單核細(xì)胞后，模型組和對(duì)照組相比，miR-146a的表達(dá)，TLR4 mRNA及T

8、RAF6、NF-κB蛋白均顯著升高(P＜0.05)，MyD88、TRAF6、NF-κB mRNA有增高趨勢(shì)（P＞0.05），細(xì)胞上清液IL-6、TNF-α水平均顯著升高（P＜0.05）;和模型組相比，miR-146a mimic組miR-146a的表達(dá)顯著升高（P＜0.01），TRAF6 mRNA及蛋白表達(dá)顯著下降（P＜0.05），TLR4、MyD88、NF-κB mRNA和NF-κB蛋白顯著升高（P＜0.01）;和模型組相比，miR-

9、146a inhibitor組miR-146a的表達(dá)顯著下降（P＜0.01），TRAF6 mRNA及蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.01），TLR4 mRNA和NF-κB蛋白表達(dá)顯著下降(P＜0.05)，NF-κB、MyD88 mRNA呈下降趨勢(shì)（P＞0.05）。miR-146a mimic和miR-146a mimic陰性對(duì)照組相比，miR-146a表達(dá)升高約1145倍，miR-146ainhibitor和miR-146a inhibito

10、r陰性對(duì)照組相比，miR-146a表達(dá)下降約5倍。②LPS刺激人THP-1單核細(xì)胞后，模型組和對(duì)照組相比，miR-146a的表達(dá)，TLR4、MyD88、TRAF6、NF-κB mRNA及TRAF6、NF-κB蛋白均顯著升高(P＜0.01)，細(xì)胞上清液IL-6、TNF-α水平均顯著升高（P＜0.01）;和模型組相比，普羅布考組miR-146a的表達(dá)、NF-κB mRNA、TRAF6蛋白均顯著下降（P＜0.05），TLR4、MyD88、TR

11、AF6 mRNA和細(xì)胞上清液TNF-α水平有下降趨勢(shì)（P＞0.05），細(xì)胞上清液IL-6水平顯著下降（P＜0.05）;和模型組相比，瑞舒伐他汀組miR-146a的表達(dá)、TLR4 mRNA、TRAF6 mRNA和蛋白、NF-κBmRNA和蛋白均顯著下降（P＜0.05），MyD88 mRNA有下降趨勢(shì)（P＞0.05），細(xì)胞上清液IL-6、TNF-α水平均顯著下降（P＜0.05）;和模型組相比，聯(lián)合組miR-146a的表達(dá)、TLR4、MyD8

12、8、TRAF6、NF-κB mRNA及TRAF6、NF-κB蛋白均顯著下降（P＜0.05），細(xì)胞上清液IL-6、TNF-α水平均顯著下降（P＜0.01)。③8周齡ApoE-/-小鼠高脂飲食喂養(yǎng)12周可以建立成功的AS模型，普羅布考、瑞舒伐他汀單藥或聯(lián)合治療可以有效的調(diào)節(jié)ApoE-/-小鼠血脂水平，減少主動(dòng)脈AS斑塊面積。模型組和對(duì)照組相比，miR-146a的表達(dá)，TLR4、TRAF6、NF-κB mRNA及TRAF6、NF-κB蛋白均顯

13、著升高(P＜0.01);和模型組相比，普羅布考組miR-146a的表達(dá)、TLR4、TRAF6、NF-κB mRNA和NF-κB蛋白均顯著下降（P＜0.05），TRAF6蛋白有下降趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;和模型組相比，瑞舒伐他汀組miR-146a的表達(dá)、TLR4及NF-κB mRNA、TRAF6和NF-κB蛋白均顯著下降(P＜0.05)，TRAF6 mRNA有下降趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;和模型組相比，聯(lián)合組miR-146a的表達(dá)、TLR4、T

14、RAF6、NF-κB mRNA及TRAF6、NF-κB蛋白均顯著下降（P＜0.05）。
　　 結(jié)論：⑴LPS（1μg/ml）刺激體外培養(yǎng)人THP-1單核細(xì)胞24小時(shí)可以建立成功的免疫炎癥損傷細(xì)胞模型。LPS刺激體外培養(yǎng)人THP-1單核細(xì)胞可以導(dǎo)致miR-146a表達(dá)升高，TLR4/NF-κB信號(hào)增強(qiáng)。⑵miR-146a能夠抑制靶基因TRAF6，miR-146a除TRAF6外，可能還存在另外一個(gè)未知靶基因，對(duì)TLR4/NF-κB通

15、路起抑制作用，miR-146a可能通過(guò)對(duì)TRAF6和未知靶基因的共同調(diào)節(jié)來(lái)調(diào)控TLR4/NF-κB炎癥信號(hào)通路。⑶普羅布考聯(lián)合瑞舒伐他汀能夠抑制LPS誘導(dǎo)人THP-1單核細(xì)胞miR-146a及TLR4/NF-κB信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而減輕炎癥因子IL-6和TNF-a的釋放起到抗AS的作用。⑷8周齡ApoE-/-小鼠高脂飲食喂養(yǎng)12周可以建立成功的AS模型，ApoE-/-小鼠AS斑塊中miR-146a表達(dá)增加。⑸ApoE-/-小鼠經(jīng)普羅布考、瑞