出生前后慢性鋁暴露對年輕大鼠海馬LTP及nNOS、NO、Ng的影響.pdf

1、鋁(aluminum)是地殼中含量最豐富的元素之一，大量蓄積可產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用。國內(nèi)外流行病學(xué)調(diào)查和研究表明，鋁易致神經(jīng)元損傷，引起智力和認知能力下降等學(xué)習(xí)和記憶方面的缺陷。目前動物實驗已證實，鋁暴露可致大鼠癡呆，其不僅表現(xiàn)為學(xué)習(xí)和記憶的行為障礙，而且其病理形態(tài)學(xué)改變也與阿爾茨海默病(AD)相似。 海馬是學(xué)習(xí)和記憶的關(guān)鍵腦區(qū)，海馬長時程增強(1ong-term potentiation，LTP)是NMDA受體依賴性突觸傳遞效能的

2、持續(xù)性增強，是公認的腦學(xué)習(xí)記憶功能在突觸水平的研究模型和神經(jīng)基礎(chǔ)。因此研究鋁暴露對海馬LTP及與其突觸機制有關(guān)的各項生化指標(biāo)的影響，有助于從突觸和蛋白分子水平闡明鋁損害腦學(xué)習(xí)和記憶功能的作用機制。目前雖然鋁對LTP損害作用的觀察很多，但其損害作用的突觸機制尚未完全闡明。 母體期和斷乳后發(fā)育期是腦發(fā)育和逐漸完善的重要階段，有關(guān)此階段鋁對學(xué)習(xí)和記憶及LTP影響的報道很少，因此我們應(yīng)該對鋁的潛在發(fā)育毒性及直接發(fā)育毒性給予特別關(guān)注。且文

3、獻檢索顯示，鋁對NO的直接影響尚未見報道。 本實驗以出生前后(包括母體期和斷乳后發(fā)育期)慢性鋁暴露為模型，觀察鋁對母體期腦發(fā)育的間接發(fā)育毒性和斷乳后腦發(fā)育期的直接發(fā)育毒性所致學(xué)習(xí)和記憶能力、LTP誘導(dǎo)與維持的改變及對海馬細胞內(nèi)nNOS、NO、Ng的影響，進一步探討鋁對學(xué)習(xí)與記憶的影響及其突觸機制，為鋁所致兒童智力和認知能力低下性神經(jīng)疾病的早期防治提供重要的實驗依據(jù)。 材料與方法： 1、動物分組與染毒：健康Wist

4、ar大鼠45只(由中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供)，體重300g左右，♀♂2:1。 2、腦組織及血液中鋁含量測定：準確稱取(0.1～0.5)g的腦組織或準確吸取(0.2～0.5)ml的全血于石英燒杯中，加(5～8)ml混酸，同時做空白對照。采用原子吸收石墨爐法測定腦鋁和血鋁含量。 3、學(xué)習(xí)與記憶的行為學(xué)測定：測試方法為跳臺法(即步下試驗)。學(xué)習(xí)行為訓(xùn)練：將大鼠放入跳臺儀內(nèi)適應(yīng)3min后訓(xùn)練其找到平臺三次，大鼠跳下平臺時，立

5、即通電給予持續(xù)電刺激(36V)并開始計時，記錄5min內(nèi)大鼠受到電刺激第一次跳上平臺躲避電擊的反應(yīng)時間(escape latency，EL)以及受到電擊的次數(shù)(number of errors)。24 h后進行記憶保持測試：記錄大鼠置于平臺到第1次跳下平臺的時間(step-down latency，SDL)和5min內(nèi)受到電擊的次數(shù)(錯誤次數(shù))。 4、電生理LTP測定：烏拉坦麻醉后，將動物頭部固定于腦立體定位儀上，暴露顱骨。將雙

6、極刺激電極插入右側(cè)海馬CA3區(qū)錐體細胞發(fā)出的Schaffer側(cè)枝部位(坐標(biāo)：前囟后3.3mm；旁開3.8 mm；皮層下3.8 mm)，將內(nèi)充3 mol/L的記錄玻璃微電極插入海馬CA1區(qū)部位(坐標(biāo)：前囟后3.3 mm；旁開1.5 mm；電極尖端抵皮層表面)，然后逐步推進行細胞外記錄。先找到穩(wěn)定的群體鋒電位(population spike，PS)后，首先記錄30min每分鐘單脈沖刺激所誘發(fā)的PS。然后觀察給予同樣強度及波寬的的短串高頻條

7、件刺激(100HZ、持續(xù)5s)后，記錄45min每分鐘給一個單脈沖檢驗刺激所誘發(fā)的PS的幅值變化。 5、nNOS表達的測定：電生理測試后的大鼠，4％多聚甲醛固定液心臟灌流固定。常規(guī)石蠟切片制作，用免疫組織化學(xué)的方法測定海馬nNOS表達。用Metamorph/Evolution/BX51顯微圖像分析系統(tǒng)進行圖像分析。 6、NO含量的測定：采用硝酸還原酶法。電生理測試后的大鼠，迅速斷頭取腦，在冰盤上快速剖取海馬，電子天平準確

8、稱重后加入9倍冷生理鹽水，按試劑盒說明進行操作。 7、Ng表達的測定：電生理測試后的大鼠，迅速斷頭取腦，在冰盤上快速剖取海馬，按體積比為1：6～1：9放到預(yù)冷的裂解緩沖液中。4℃超聲粉碎后12 000 r/min離心1 h，取上清分裝。按照常規(guī)Western blot方法分離蛋白質(zhì)。將蛋白印跡顯影圖掃描，再利用ChemiImager 5500 V2103圖像分析軟件對實驗結(jié)果(測定目標(biāo)帶灰度值)進行分析。 8、海馬形態(tài)學(xué)

9、超微結(jié)構(gòu)觀察：取大鼠海馬用常規(guī)透射電鏡觀察出生前后慢性鋁暴露情況下年輕大鼠的神經(jīng)細胞的形態(tài)變化。 9、統(tǒng)計學(xué)處理：實驗所得數(shù)據(jù)資料用x±s表示，組間資料統(tǒng)計用(SPSS軟件)單因素方差分析(ANOVA)檢驗，行為學(xué)數(shù)據(jù)不服從正態(tài)分布，采用秩和檢驗。 實驗結(jié)果： 1、各組大鼠血鋁和腦鋁含量的比較隨著鋁暴露劑量的升高，鋁暴露組大鼠的血鋁、腦鋁含量逐漸升高，且均顯著高于對照組(P<0.05或P<0.01)，兩鋁暴露組間

10、差異也顯著(P<0.05)。 2、各組大鼠學(xué)習(xí)和記憶行為學(xué)的改變與對照組相比，兩鋁暴露組大鼠第一次跳上平臺的時間(反應(yīng)時間)均明顯延長(P<0.01)，跳下平臺的潛伏期明顯縮短(P<0.01)，5min內(nèi)錯誤次數(shù)顯著增加(P<0.01)，且兩鋁暴露組間亦有顯著性差異(P<0.01或P<0.05)。 3、各組大鼠PS幅值變化(即LTP增強率)的比較隨著鋁暴露劑量的升高，高頻刺激后PS幅值增強率依次降低，兩鋁暴露組與對照組相

11、比，顯著降低(P<0.01)，但兩暴露組之間差異不顯著。 4、各組大鼠海馬nNOS表達的變化與對照組相比，各鋁暴露組海馬CA1、CA3區(qū)nNOS表達均顯著減少，且兩暴露組組間也有極顯著性差異(P<0.01)。 5、各組大鼠海馬細胞內(nèi)NO含量的變化隨著鋁暴露劑量的升高，大鼠海馬細胞內(nèi)NO含量依次降低。兩鋁暴露組均明顯低于對照組(P<0.01)，且兩暴露組間也有極顯著性差異(P<0.01)。 6、各組大鼠海馬細胞內(nèi)N

12、g表達的變化隨著染鋁濃度的增加，Ng表達量降低。與對照組相比，各染毒組海馬胞內(nèi)Ng含量均顯著降低，但兩鋁暴露組組間差異不顯著。 7、各組大鼠海馬形態(tài)學(xué)超微結(jié)構(gòu)觀察與對照組相比，兩鋁暴露組海馬神經(jīng)元受到損傷，細胞膜和細胞質(zhì)溶解，核破損，細胞器破壞。 討論 母體期和斷乳后發(fā)育期腦的功能受損的研究是一個關(guān)系到嬰幼兒智力健康發(fā)育的重要問題，同時，研究鋁對此階段腦發(fā)育的影響及其機制，對預(yù)防鋁所致神經(jīng)性疾病有著重要意義。本實

13、驗觀察到，出生前后慢性鋁暴露(孕期、哺乳期和斷乳后發(fā)育期)的各組年輕大鼠腦鋁及血鋁含量均顯著升高。與對照組相比，兩鋁暴露組的學(xué)習(xí)和記憶能力及LTP誘導(dǎo)與維持均明顯下降，表明出生前后的鋁暴露，可通過胎盤和血腦屏障進入子代大鼠體內(nèi)，造成鋁在子代體內(nèi)蓄積，特別是腦內(nèi)的蓄積，進而損害了子代鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力。本實驗還觀察到，各組海馬細胞內(nèi)nNOS、Ng表達及NO含量也明顯降低，提示，出生前后連續(xù)慢性鋁暴露年輕大鼠學(xué)習(xí)記憶能力減退的可能原因之一是

14、鋁干擾了nNOS的表達，進一步抑制了NO的生成。另一原因可能是鋁抑制了Ng的表達。 就我們所涉獵的文獻顯示，鋁可干擾谷氨酸能神經(jīng)傳遞、NMDA受體相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，鋁可抑制參與胞內(nèi)鈣信號調(diào)節(jié)的多種分子途徑，鋁可降低小腦內(nèi)鈣調(diào)蛋白(CaM)的含量，鋁還可使膽堿能和去甲腎上腺素能神經(jīng)傳遞發(fā)生改變?？梢?，鋁損傷了LTP誘導(dǎo)中的一系列環(huán)節(jié)，使Glu、NMDA受體、Ca2+與CaM均減少，必然影響其下游過程。 Ca2+/CaM可

15、激活nNOS，鋁可抑制nNOS的表達，也可通過降低Ca2+濃度及CaM使nNOS激活減少，從而使NO生成減少。此外，Ng是CaM的儲庫，鋁可抑制Ng的表達。通過上述途徑導(dǎo)致LTP的誘導(dǎo)和維持受阻，致使大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力下降。鋁能夠引起線粒體和DNA的損傷進而導(dǎo)致神經(jīng)元細胞的損傷和凋亡。 總之，鋁可損害LTP誘導(dǎo)中的多種突觸機制，從而損害大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力。 結(jié)論： (1)出生前后慢性鋁暴露使大鼠學(xué)習(xí)測試的反應(yīng)時

16、間顯著延長，記憶測試的潛伏期明顯縮短，5min錯誤次數(shù)均顯著增加，提示鋁暴露損害了大鼠的學(xué)習(xí)和記憶行為。 (2)出生前后慢性鋁暴露使PS幅值增強率減小，提示該暴露損害了大鼠LTP的誘導(dǎo)與維持。 (3)出生前后慢性鋁暴露使海馬細胞內(nèi)nNOS表達減少，進而使NO含量顯著降低，提示這可能是鋁損害LTP的另一突觸機制。 (4)出生前后慢性鋁暴露使海馬細胞內(nèi)Ng表達減少，可能是鋁損害LTP的機制之一。 (5)出生前