福州地區(qū)急性呼吸道感染兒童HCoV-NL63和HCoV-HKU1的檢測與分析.pdf

1、目的：分別建立人冠狀病毒NL63(Human Coronavirus NL63)和人冠狀病毒HKU1(Human Coronavirus HKU1)的實時熒光定量PCR(Real-time Fluorescent Quantitative PCR，F(xiàn)Q-PCR)方法檢測并了解福州地區(qū)急性呼吸道感染(ARTI)患兒HCoV-NL63與HCoV-HKU1感染情況。
　　 方法：分別設(shè)計HCoV-NL63多聚酶蛋白1a基因、HCoV-

2、HKU1 pol基因的引物和Taqman探針。擴(kuò)增1a基因片段、pol基因片段并將其克隆到PMD18-T載體上，構(gòu)建質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，建立實時熒光定量PCR檢測方法，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行敏感性、特異性試驗，重復(fù)性試驗。用建立好的熒光定量PCR檢測收集到的151份臨床ARTI患兒標(biāo)本中兩種病毒的感染情況，對結(jié)果進(jìn)行比較分析。擴(kuò)增HCoV-NL63核衣殼蛋白N基因與包膜蛋白E基因，對其序列進(jìn)行初步分析。
　　 結(jié)果：
　　 1、建立

3、的FQ-PCR方法檢測HCoV-NL63，線性范圍為101copies/μ l～109copies/μl，批內(nèi)變異系數(shù)為0.9％，批間變異系數(shù)為1.6％。用建立的HCoV-NL63實時熒光定量PCR方法檢測2008-2009年度冬春季151例臨床標(biāo)本，共檢出陽性2例，陽性率為1.3％(2/151)。普通PCR法檢測結(jié)果與FQ-PCR檢測結(jié)果一致。
　　 2、福州地區(qū)HCoV-NL63的N基因核苷酸序列，氨基酸序列與GenBank

4、中登錄的原型株HCoV-NL63的N基因一致性均達(dá)97％以上，氨基酸序列與原型株有3個氨基酸的改變。HCoV-NL63的E基因核苷酸序列與GenBank中登錄的原型株一致性達(dá)99％以上，氨基酸序列與原型株完全相同。
　　 3、建立的FQ-PCR方法檢測HCoV-HKU1，線性范圍為102copies/μl～109copies/μl，批內(nèi)變異系數(shù)為1.2％，批間變異系數(shù)為0.5％。用建立的HCoV-HKU1實時熒光定量PCR方法檢

5、測151例臨床標(biāo)本，未檢出陽性標(biāo)本。但用本法檢測先前本實驗室保存的2006-2007年度用普通RT-PCR檢測出的一份HCoV-HKU1陽性標(biāo)本，也顯示陽性。
　　 結(jié)論：
　　 1、本研究建立的HCoV-NL63、HCoV-HKU1 FQ-PCR檢測方法靈敏度、重復(fù)性、特異性均較好，可用于臨床呼吸道標(biāo)本的檢測以及流行病學(xué)監(jiān)測。
　　 2、福州地區(qū)HCoV-NL63的N基因、E基因均與原型株同源性高。