腺病毒介導(dǎo)ChM-I基因抑制BMSCs體內(nèi)構(gòu)建的軟骨血管化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是軟骨組織工程中倍受關(guān)注的種子細(xì)胞，具有很高的研究意義和廣泛的應(yīng)用前景。但應(yīng)用BMSCs構(gòu)建的軟骨組織經(jīng)體內(nèi)長期移植后，會(huì)發(fā)生一系列表型不穩(wěn)定現(xiàn)象，比如喪失表達(dá)Ⅱ型膠原的能力，這些嚴(yán)重地影響利用BMSCs進(jìn)行軟骨缺損的長期修復(fù)效果。這一系列表型變化現(xiàn)象類似于軟骨內(nèi)骨化的發(fā)生過程，即軟骨組織先出現(xiàn)肥大、鈣化現(xiàn)象，并伴隨有血管的侵入，隨著體內(nèi)

2、移植時(shí)間的增長血管化程度逐漸增加，漸漸礦化形成骨組織。該過程中血管化的侵入是誘導(dǎo)軟骨向骨轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵步驟。然而正常的軟骨組織在促血管發(fā)生的微環(huán)境中，仍可持續(xù)保持無血管的狀態(tài)及穩(wěn)定的軟骨表型，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，其中存在的一種特異性的生長因子——軟骨調(diào)節(jié)素-1(Chondromodulin-I，ChM-I)，具有強(qiáng)效的抑制血管發(fā)生的功能。我們推測BMSCs在分化為軟骨的過程中ChM-I不表達(dá)或者表達(dá)很低，從而才會(huì)導(dǎo)致血管侵入、軟骨表型丟失現(xiàn)象的發(fā)生

3、。目前，對BMSCs及其分化形成的軟骨中ChM-I是否表達(dá)尚無文獻(xiàn)報(bào)道。因此，我們從ChM-I基因在BMSCs和軟骨細(xì)胞中是否存在表達(dá)差異出發(fā)，研究ChM-I對BMSCs體內(nèi)構(gòu)建的軟骨血管化的抑制作用，分析其在軟骨表型丟失過程的影響。
　　 目的：觀察軟骨細(xì)胞對BMSCs體內(nèi)構(gòu)建軟骨的血管化的抑制作用，對比抗血管生成因子ChM-I的基因在兩種細(xì)胞間的表達(dá)差異，并探討ChM-I抑制BMSCs體內(nèi)構(gòu)建軟骨血管化的作用，為改善和提高B

4、MSCs來源的軟骨組織的表型穩(wěn)定性提供新的思路。
　　 方法和結(jié)果：
　　 ⑴BMSCs與軟骨細(xì)胞以不同比例(3∶1，1:1，1:3)混合，接種至珊瑚材料上，移植到裸鼠皮下，同時(shí)分別以單純BMSCs和軟骨細(xì)胞為陰性和陽性對照組，體內(nèi)培養(yǎng)1～2個(gè)月后，觀察構(gòu)建的組織工程軟骨的血管化程度，并分析抗血管生成因子ChM-I在不同組中的表達(dá)分布。大體觀察和組織學(xué)結(jié)果可見，單純BMSCs構(gòu)成的組織中血管化程度很高，而且有少量成骨出現(xiàn)

5、。相反，含有軟骨細(xì)胞的各實(shí)驗(yàn)組均可形成血管化程度極低的軟骨組織，在軟骨細(xì)胞含量很少(25％)時(shí)也可保持很低的血管化水平。免疫熒光結(jié)果顯示，ChM-I在陽性對照組及各個(gè)實(shí)驗(yàn)組都有不同程度的表達(dá)分布，而單純BMSCs構(gòu)成的組織中沒有。
　　 ⑵用RT-PCR的方法比較ChM-I基因在BMSCs和關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞之間的表達(dá)差異。結(jié)果顯示ChM-I在BMSCs中幾乎不表達(dá)，此外，兩種細(xì)胞之間II型膠原和蛋白聚糖的表達(dá)也存在顯著的差異。

6、>　　 ⑶獲得兔ChM-I基因克隆，構(gòu)建重組腺病毒Ad5-ChM-I。用RT-PCR的方法從兔的關(guān)節(jié)軟骨組織中獲得了ChM-I基因克隆，通過測序驗(yàn)證了其正確性，并成功的構(gòu)建了高滴度的重組腺病毒Ad5-ChM-I。
　　 ⑷轉(zhuǎn)染重組腺病毒Ad5-ChM-I的BMSCs與珊瑚材料復(fù)合物移植到裸鼠皮下1～2個(gè)月后，觀察體內(nèi)構(gòu)建的軟骨組織的血管化的程度，分析軟骨表型的變化。大體觀察和組織學(xué)結(jié)果可見，轉(zhuǎn)染Ad5-ChM-I的BMSCs在

7、體內(nèi)形成的軟骨組織的血管化程度很低，免疫熒光結(jié)果顯示，ChM-I在轉(zhuǎn)染后的BMSCs形成的組織中有一定的表達(dá)分布。
　　 結(jié)論：ChM-I基因在BMSCs和軟骨細(xì)胞中確實(shí)存在顯著的表達(dá)差異，BMSCs中幾乎不表達(dá)ChM-I，軟骨細(xì)胞及其特異性表達(dá)的ChM-I均可以抑制BMSCs體內(nèi)構(gòu)建的軟骨組織的血管化發(fā)生，阻止其向骨的表型發(fā)生轉(zhuǎn)變，在一定程度上穩(wěn)定了軟骨表型。因此，我們可以將腺病毒介導(dǎo)的ChM-I基因修飾的BMSCs作為新型的