山核桃干腐病抑制菌的篩選及抑制機(jī)理探究.pdf

1、山核桃干腐病是導(dǎo)致山核桃樹(shù)病害甚至死亡的病原菌之一，給我國(guó)山核桃發(fā)展帶來(lái)了嚴(yán)重的威脅，目前危害面積還在持續(xù)擴(kuò)大。山核桃干腐病病原菌為葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea。本論文以天目山雷竹林土壤中分離純化得到的103株菌株為材料，通過(guò)平板對(duì)峙法篩選對(duì)山核桃干腐病病原菌具有抑制作用的生防菌，鑒定其菌種以及活性代謝物質(zhì)的名稱。主要結(jié)果如下：
　?。?）抑制菌篩選。平板對(duì)峙法篩選出一株對(duì)病原菌有明顯抑制效果的芽孢桿菌

2、，命名為WK1。通過(guò)菌體表型特征分析、生理生化特征分析及16S rDNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析方法鑒定了WK1的分類學(xué)地位。結(jié)果表明WK1菌株屬于芽孢桿菌屬，為解淀粉芽孢桿菌植物亞種B.amyloliquefaciens subsp.plantarum。
　?。?）抑制機(jī)理的探究。通過(guò)掃描電鏡探究WK1菌株對(duì)山核桃干腐病病原菌的抑制機(jī)理。與抑制菌WK1對(duì)峙培養(yǎng)4d、6d和7d后，比較病原菌B.dothidea菌絲和孢子形態(tài)，發(fā)現(xiàn)病

3、原菌菌絲出現(xiàn)萎縮干癟現(xiàn)象，且培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)，菌絲萎縮干癟程度越大；對(duì)峙培養(yǎng)4d時(shí)病原菌孢子正常，而到第6d時(shí)部分病原菌孢子表現(xiàn)出凹陷、萎縮現(xiàn)象，第7d異常孢子數(shù)量增加。將滅菌發(fā)酵上清液與水分別按V(上清液)∶V(水)＝1∶9，2∶8，5∶5的比例配制成的PDA混合培養(yǎng)基培養(yǎng)病原菌，結(jié)果病原菌菌絲抑制率分別62.53％、77.29%和90.45%，說(shuō)明滅菌發(fā)酵上清液對(duì)病原菌有抑制作用。電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，病原菌菌絲在含有滅菌發(fā)酵上清液的PDA混合

4、培養(yǎng)基上出現(xiàn)萎縮干癟現(xiàn)象。因此，WK1菌體及其代謝產(chǎn)物均通過(guò)破壞菌絲和孢子細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，使細(xì)胞內(nèi)原生質(zhì)泄露，從而導(dǎo)致菌絲和孢子萎縮。
　　（3）抑制活性物質(zhì)的鑒定。利用HPLC、LC-MS技術(shù)對(duì)WK1脂肽粗提物進(jìn)行定性定量分析，發(fā)現(xiàn)WK1含有surfactin，iturin，fengycin三大類脂肽，且在fengycin區(qū)域相對(duì)含量較高。對(duì)fengycin區(qū)域6個(gè)主要峰進(jìn)行LC-MS單一質(zhì)譜峰解析表明，WK1脂肽粗提物的fen

5、gycin區(qū)域主要成分是C15-C18Fengycin A。
　?。?）抑制活性物質(zhì)廣譜抗真菌性檢測(cè)。通過(guò)紙片瓊脂擴(kuò)散法對(duì)WK1脂肽粗提物的抑菌譜進(jìn)行測(cè)定，證明脂肽粗提物對(duì)杉木枯萎病、棉花黃病、哈密瓜枯萎病、黃瓜枯萎病、立枯絲核菌、蔬菜根腐病、茄子辣椒根腐病這7種病原菌菌絲生長(zhǎng)有抑制作用。抑制效果在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)隨粗提物濃度的增加而增強(qiáng)。在脂肽粗提物為0.625mg/ml濃度下，可對(duì)杉木枯萎病、黃瓜枯萎病、茄子辣椒根腐病病原菌產(chǎn)生抑菌