規(guī)模化牧場(chǎng)布魯氏菌病血清學(xué)調(diào)查與iELISA檢測(cè)方法的建立.pdf

1、目前我國(guó)布魯氏菌病主要的診斷方法為細(xì)菌分離培養(yǎng)和血清學(xué)檢測(cè)，但滿足不了快速檢測(cè)和大群檢測(cè)的要求，且容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。為了更好的診斷和預(yù)防布魯氏菌病，需要研究新型的檢測(cè)方法來(lái)滿足快速和大群檢測(cè)的要求。
　　1.自2013年1月-2014年12月，本實(shí)驗(yàn)室用虎紅平板凝集試驗(yàn)的方法對(duì)送檢和采集的疑似布魯氏菌病奶牛血清樣本進(jìn)行了檢測(cè)，初步篩查了奶牛場(chǎng)布魯氏菌病的流行情況。共計(jì)檢測(cè)奶牛血清樣本數(shù)為8160份，其中陽(yáng)性血清樣數(shù)本為1768份，占

2、檢測(cè)總樣本數(shù)的21.67％。流產(chǎn)檢測(cè)的奶牛血清樣本數(shù)為898份，其中陽(yáng)性血清樣本數(shù)為400份，占流產(chǎn)檢測(cè)總樣本數(shù)的44.54％;大群檢測(cè)的奶牛血清樣本數(shù)為7262份，其中陽(yáng)性血清樣本數(shù)為1368份，占大群檢測(cè)總樣本數(shù)的18.84％。
　　2.布魯氏菌外膜蛋白OMP16有良好的免疫原性，是亞單位疫苗的熱門(mén)候選。T4SS是布魯氏菌的胞內(nèi)寄生所必須的毒力因子。2011年，Marchesini MI等利用CyaA報(bào)告系統(tǒng)鑒定BPE123、

3、BPE275、BPE005和BPE043是由T4SS分泌的效應(yīng)蛋白。它們?cè)诓剪斒暇麅?nèi)運(yùn)輸過(guò)程中起到重要的調(diào)節(jié)作用，其是否具有良好的免疫原性還沒(méi)有被證明。因此，本試驗(yàn)挑選了OMP16和BPE123兩個(gè)基因，純化其重組蛋白，嘗試建立間接ELISA檢測(cè)方法。
　　據(jù)GenBank中布魯氏菌OMP16和BPE123的基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物，擴(kuò)增OMP16和BPE123基因片段。用OMP16和BPE123基因構(gòu)建克隆質(zhì)粒，同時(shí)進(jìn)行雙酶切

4、和測(cè)序鑒定，陽(yáng)性質(zhì)粒命名為pET-T3-OMP16和pET-T3-BPE123。同時(shí)對(duì)克隆質(zhì)粒pET-T3-OMP16、pET-T3-BPE123和pET-32a(+)表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切?；厥漳康幕蚱蜲MP16、BPE123以及pET-32a(+)線性片段，用連接酶將它們連接，構(gòu)建陽(yáng)性表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-OMP16和pET-32a-BPE123。隨后將二者轉(zhuǎn)入宿主菌大腸桿菌中，構(gòu)建表達(dá)菌pET-32a-OMP16-BL21和pE

5、T-32a-BPE123-BL21。用IPTG誘導(dǎo)構(gòu)建的表達(dá)菌進(jìn)行表達(dá)，并對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化。利用SDS-PAGE和Western-blot分析鑒定表達(dá)的蛋白。用Ni-NTASpin Kit大量純化并收集重組蛋白。以純化的蛋白OMP16和BPE123作為包被抗原，嘗試構(gòu)建iELISA檢測(cè)方法。在嘗試試驗(yàn)中確定抗原的最佳包被濃度和最佳包被條件;確定二抗的最佳稀釋度以確定及陰陽(yáng)性臨界值，同時(shí)確定試驗(yàn)敏感性和試驗(yàn)重復(fù)性。用建立的iELIS

6、A方法檢測(cè)245份奶牛血清樣本，并與虎紅平板凝集試驗(yàn)作對(duì)照，判斷該方法的符合率。
　　純化了OMP16和BPE123蛋白，成功構(gòu)建以O(shè)MP16為包被抗原的iELISA檢測(cè)方法。該檢測(cè)方法與虎紅平板凝集試驗(yàn)的符合率達(dá)91.38％。BPE123蛋白在嘗試建立iELISA檢測(cè)方法時(shí)，出現(xiàn)多種不能區(qū)分陰陽(yáng)血清的問(wèn)題，未能成功構(gòu)建BPE123蛋白的iELISA檢測(cè)方法。
　　結(jié)論:布魯氏菌病流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，布病在全國(guó)范圍內(nèi)的許多