Rho激酶參與氫氣保護LPS誘導(dǎo)離體人結(jié)腸上皮屏障功能障礙的機制研究.pdf

1、目的：
　　膿毒癥是感染所致的嚴(yán)重威脅生命的全身炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS）。膿毒癥常繼發(fā)于創(chuàng)傷、大手術(shù)等重大應(yīng)激事件，可發(fā)生于各個年齡段的患者。膿毒癥發(fā)生率、病死率高，幸存者也常因為并發(fā)癥和后遺癥而導(dǎo)致生活質(zhì)量嚴(yán)重下降。腸屏障的破壞一直以來被認(rèn)為是引發(fā)膿毒癥感染和多器官功能障礙綜合征（MODS）的始動因素之一。腸屏障的構(gòu)成錯綜復(fù)雜，是人體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，因此日益成為膿毒癥研究的熱點和重點。氫氣是大氣層中自然存在的氣體，人體

2、中也有微量的氫以分子形式存在。文獻(xiàn)報道，一定濃度的氫氣對多種疾病有治療作用，并已經(jīng)通過許多模型證實。氫氣治療的具體機制目前還不十分明確。Rho激酶（ROCK）是一種絲/蘇氨酸激酶，廣泛存在于哺乳動物體細(xì)胞內(nèi)，參與多種細(xì)胞生命活動。本研究旨在探究氫氣對膿毒癥離體人腸上皮細(xì)胞屏障功能的影響，以及Rho激酶是否參與了氫氣的作用機制。
　　方法：
　　人結(jié)腸腺癌細(xì)胞系Caco-2，培養(yǎng)于無菌含20％胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，傳代

3、培養(yǎng)至對數(shù)期用于實驗研究。
　　第一部分：用 Transwell小室建立 Caco-2單層細(xì)胞屏障模型，或?qū)⒓?xì)胞接種到96孔板或6孔板中。實驗分為6組：對照組（C組）、0.1mg/L細(xì)菌脂多糖（LPS）處理組（L1組）、1mg/L LPS處理組（L2組）、10mg/L LPS處理組（L3組）、50mg/L LPS處理組（L4組）、100mg/L LPS處理組（L5組）。處理24h后通過檢測跨上皮電阻值（TEER）和FITC-右旋糖

4、酐通過率來觀察Caco-2單層細(xì)胞屏障完整性和通透性的改變，MTT法檢測細(xì)胞凋亡情況，Western Blot法檢測處理24h后腸上皮細(xì)胞間緊密連接蛋白 ZO-1的表達(dá)水平。根據(jù)結(jié)果選擇能滿足實驗需要的LPS處理濃度。
　　第二部分：同第一部分建立細(xì)胞模型，實驗分為5組：對照組（C組）、富氫培養(yǎng)基組（H組）、細(xì)菌脂多糖（LPS）處理組（L組）、富氫培養(yǎng)基+LPS處理組（HL組）、ROCK抑制劑（Y-27632）+LPS處理組（YL

5、組）。對照組與富氫培養(yǎng)基組分別加入等容量DMEM空白高糖培養(yǎng)基和0.6mmol/L富氫培養(yǎng)基。LPS處理濃度為50mg/L，Y-27632處理濃度為25μmol/L。分別于0h、6h、12h、24h四個時間點檢測跨上皮細(xì)胞電阻值（TEER）和24h FITC-右旋糖酐通過率，MTT法檢測處理24h后細(xì)胞凋亡水平，Western Blot法檢測6h、12h、24h細(xì)胞間緊密連接蛋白ZO-1和ROCK蛋白的表達(dá)水平，實時聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PC

6、R）技術(shù)檢測處理6h、12h、24h后Caco-2細(xì)胞ZO-1 mRNA和ROCK mRNA表達(dá)水平，細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測處理24h后Caco-2細(xì)胞ZO-1蛋白分布變化。
　　結(jié)果：
　　第一部分：與對照組相比，0.1mg/L LPS未能引起跨上皮電阻值和FITC-右旋糖酐通過率的顯著改變和 Caco-2細(xì)胞凋亡水平的顯著上升（P＞0.05），也未能顯著降低Caco-2細(xì)胞間緊密連接蛋白ZO-1的表達(dá)（P＞0.05）；1m

7、g/L和10mg/L濃度的LPS能引起跨上皮電阻值和FITC-右旋糖酐通過率的顯著改變（P＜0.05），并顯著增加Caco-2細(xì)胞凋亡（P＞0.05），但未能顯著降低Caco-2細(xì)胞間緊密連接蛋白ZO-1的表達(dá)（P＞0.05）；50mg/L和100mg/L濃度的LPS既能降低跨上皮電阻值，增加FITC-右旋糖酐通過率（P＜0.05），即破壞了單層細(xì)胞屏障的完整性，增加其通透性；也顯著增加了 Caco-2細(xì)胞的凋亡（P＜0.05），并降低

8、了Caco-2細(xì)胞間ZO-1蛋白的表達(dá)（均P＜0.05）。因此本研究選用50mg/L的LPS處理濃度。
　　第二部分：與對照組比較，LPS顯著降低了跨上皮電阻，增加了FITC-右旋糖酐通過率，降低了ZO-1 mRNA和蛋白表達(dá)，并引起了ROCK mRNA和蛋白的過表達(dá)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。LPS引起主要分布于Caco-2細(xì)胞間的ZO-1蛋白向細(xì)胞內(nèi)聚集，而細(xì)胞膜上的ZO-1蛋白分布減少,分布的連續(xù)性被破壞。與LPS

9、處理組比較ROCK抑制劑Y-27632或富氫培養(yǎng)基的加入弱化了LPS對跨上皮電阻值和FITC-右旋糖酐通過率的影響（P＜0.05）；富氫培養(yǎng)基改善了LPS引起的Caco-2細(xì)胞凋亡增加的情況（P＜0.05），ROCK對LPS引起的Caco-2細(xì)胞凋亡增加無顯著影響（P＞0.05）；ROCK抑制劑或富氫培養(yǎng)基抑制了 LPS對ZO-1 mRNA和蛋白的下調(diào)，降低了LPS誘導(dǎo)的ROCK mRNA和蛋白過表達(dá)，并減弱了 ZO-1蛋白從 Caco