黃酮類化合物對(duì)LPS刺激下THP-1細(xì)胞炎癥因子釋放的影響.pdf

1、膿毒癥（sepsis）是指由感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)，其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，可能涉及到復(fù)雜的全身炎癥網(wǎng)絡(luò)效應(yīng)、基因多態(tài)性、免疫功能障礙、凝血功能異常、組織損傷以及宿主對(duì)不同感染病原微生物及其毒素的異常反應(yīng)等多個(gè)方面，與機(jī)體多系統(tǒng)、多器官病理生理改變密切相關(guān)。膿毒癥是臨床常見的急危重癥之一，也是誘發(fā)膿毒性休克、多器官功能障礙綜合征（mult

2、iple organism dysfunction syndrome, MODS）的重要原因。由于膿毒癥來勢(shì)兇猛、病情進(jìn)展迅速、病死率高，給臨床救治工作帶來極大困難。所以如何早期識(shí)別、及時(shí)診斷、有效防治膿毒癥，是提高急危重癥救治成功率的關(guān)鍵。目前，已認(rèn)識(shí)到全身炎癥反應(yīng)是膿毒癥的病理基礎(chǔ)，在膿毒癥的發(fā)展過程中有著十分重要的意義。在全身感染的情況下，單核細(xì)胞受細(xì)菌毒素攻擊可釋放促炎性介質(zhì)，如腫瘤壞死因子-a（tumor necrosis f

3、actor-a, TNF-a）、白介素（interleukin）-1、4、6、8等，加上其他細(xì)胞因子、補(bǔ)體片段、花生四烯酸衍生物、一氧化氮等的過度釋放，可造成廣泛的組織破壞。故對(duì)炎癥反應(yīng)的有效干預(yù)及治療被認(rèn)為是治療膿毒癥的關(guān)鍵所在。近年來，各種各樣的抗炎試驗(yàn)性治療已成為探索膿毒癥防治策略的熱點(diǎn)。如采用血液濾過清除多種細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)，應(yīng)用烏司他丁穩(wěn)定細(xì)胞膜、抑制TNF-a/IL-1β的釋放阻斷炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，均被證實(shí)取得一定的療效。但膿

4、毒癥的病死率仍然居高不下，使尋找更加有效的抗炎方案成為迫切需要。黃酮類化合物是最常見的多酚類化合物，廣泛分布于不同種類植物中。其背景膿毒癥（sepsis）是指由感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)，其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，可能涉及到復(fù)雜的全身炎癥網(wǎng)絡(luò)效應(yīng)、基因多態(tài)性、免疫功能障礙、凝血功能異常、組織損傷以及宿主對(duì)不同感染病原微生物及其毒素的異常反應(yīng)等多

5、個(gè)方面，與機(jī)體多系統(tǒng)、多器官病理生理改變密切相關(guān)。膿毒癥是臨床常見的急危重癥之一，也是誘發(fā)膿毒性休克、多器官功能障礙綜合征（multiple organism dysfunction syndrome, MODS）的重要原因。由于膿毒癥來勢(shì)兇猛、病情進(jìn)展迅速、病死率高，給臨床救治工作帶來極大困難。所以如何早期識(shí)別、及時(shí)診斷、有效防治膿毒癥，是提高急危重癥救治成功率的關(guān)鍵。本研究通過脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）

6、誘導(dǎo)人白血病單核細(xì)胞株（human acute monocytic leukemia cell line, THP-1）釋放炎癥因子，模擬體內(nèi)內(nèi)毒素誘導(dǎo)單核細(xì)胞釋放細(xì)胞因子介導(dǎo)膿毒癥的炎癥過程，再利用黃酮類化合物，包括高良姜素、白楊素、異鼠李素、山奈素進(jìn)行干預(yù)，了解這四種黃酮類化合物的抗炎作用，以其為膿毒癥治療提供新的治療手段。
　　目的：⑴明確高良姜素、白楊素、異鼠李素、山奈素四種黃酮類化合物對(duì)LPS刺激下THP-1細(xì)胞炎癥因子

7、釋放的影響及其抗炎特征。⑵為探索黃酮類化合物調(diào)控炎癥因子釋放的機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法：①對(duì)THP-1細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代，并用碘化丙啶（propidium iodide, PI）單染色法檢測(cè)細(xì)胞壞死率，剩余細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)和凍存。②以不同濃度 LPS（0ng/ml、100ng/ml、250ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml、2000ng/ml）刺激THP-1細(xì)胞，并在不同時(shí)間點(diǎn)（24h、48h）用ELISA法檢

8、測(cè)其炎癥因子白介素-6（interleukin-6, IL-6）釋放的水平及用PI單染色法檢測(cè)其細(xì)胞存活率，以得出最佳刺激濃度。③以500ng/ml的LPS刺激THP-1細(xì)胞，并同時(shí)用不同種類黃酮類化合物（高良姜素、異鼠李素、白楊素、山奈素）以不同濃度（5μmol/l、10μmol/l、15μmol/l）進(jìn)行干預(yù)，24小時(shí)后分別收集上清液用ELISA法檢測(cè)其炎癥因子單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic prot

9、ein-1, MCP-1）、TNF-a、IL-6的釋放水平。④以500ng/ml的LPS刺激 THP-1細(xì)胞，并同時(shí)用異鼠李素在不同濃度（7.5μmol/l、15μmol/l、30μmol/l、60μmol/l）干預(yù)，分別3、6、12、24小時(shí)收集細(xì)胞上清液用ELISA法檢測(cè)其炎癥因子MCP-1、IL-6、TNF-a的釋放水平。
　　結(jié)果：⑴以不同濃度LPS（0 ng/ml、100 ng/ml、250 ng/ml、500 ng/m

10、l、1000 ng/ml、2000 ng/ml）刺激THP-1細(xì)胞，無論是24h組還是48h組IL-6的釋放水平均較空白對(duì)照組明顯上升（P<0.05），但相同LPS刺激濃度下兩組間的IL-6釋放水平均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。⑵高良姜素、白楊素、山奈素、異鼠李素均能抑制THP-1細(xì)胞基礎(chǔ)狀態(tài)下IL-6、MCP-1的釋放（P<0.05）。⑶高良姜素、白楊素、山奈素對(duì)LPS誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞炎癥因子的釋放也有不同程度的影響，高良姜素在

11、從5μmol/l起抑制IL-6、TNF-a的釋放，但對(duì)MCP-1釋放的影響并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；白楊素、山奈素也有類似的發(fā)現(xiàn)。⑷異鼠李素在7.5μmol/l時(shí)便可降低MCP-1的釋放水平（P<0.05），并呈濃度依賴性（P<0.05）。異鼠李素對(duì)MCP-1的抑制率在12小時(shí)達(dá)到高峰。⑸在對(duì)IL-6釋放水平的影響的研究中發(fā)現(xiàn)，在3h組中，異鼠李素從15μmol/l起呈濃度依賴性地抑制IL-6的釋放（P<0.05）；而在6、12、

12、24h組中，異鼠李素從7.5μmol/l起對(duì)IL-6的釋放水平表現(xiàn)出明顯的抑制作用，也呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性（P<0.05）。⑹在對(duì)TNF-a釋放水平的影響的研究中發(fā)現(xiàn)，在3h及24h組中，從15μmol/l起，隨著異鼠李素濃度的升高，TNF-a的釋放水平明顯下降（P<0.05）；在6、12h組中，異鼠李素從從7.5μmol/l起對(duì)TNF-a的釋放表現(xiàn)出明顯的抑制作用（P<0.05）。異鼠李素對(duì)TNF-a的抑制率在3小時(shí)達(dá)到高峰。