版權(quán)說(shuō)明:本文檔由用戶(hù)提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請(qǐng)進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)
文檔簡(jiǎn)介
1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開(kāi)論述:
第一部分 OCT4靶向miRNA的系統(tǒng)性篩選
目的:從目前已知的人類(lèi)miRNA中篩選出能特定靶向結(jié)合到OCT43’UTR端,并能引起OCT4表達(dá)下調(diào)的miRNA。
方法:應(yīng)用多種生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)OCT43’UTR的靶向miRNA,然后通過(guò)構(gòu)建OCT4-3’UTR熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)質(zhì)粒,同預(yù)測(cè)的miRNA共轉(zhuǎn)染檢測(cè)相對(duì)熒光素酶活性;隨后將篩選出的miRNA轉(zhuǎn)染膀胱癌細(xì)胞系
2、內(nèi),選擇出能下調(diào)OCT4表達(dá)的miRNA;構(gòu)建OCT43’UTR突變體熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)質(zhì)粒,同相應(yīng)的miRNA共轉(zhuǎn)染后檢測(cè)相對(duì)熒光素酶活性,得到通過(guò)結(jié)合OCT43’UTR下調(diào)OCT4表達(dá)的miRNA
結(jié)果:應(yīng)用軟件TargetScan預(yù)測(cè)結(jié)果有7-8個(gè)堿基可配對(duì)結(jié)合,4個(gè)miRNA結(jié)合強(qiáng)度為conserved,50個(gè)miRNA結(jié)合強(qiáng)度為poorly conserved;miRDB以默認(rèn)參數(shù)對(duì)結(jié)合能力評(píng)分排序,得到7個(gè)miR
3、NA;miRanda以默認(rèn)參數(shù)預(yù)測(cè)評(píng)分,得到11個(gè)miRNA;miRWalk與Pictar軟件未得出有意義的結(jié)果。合并后預(yù)測(cè)出61個(gè)miRNA與OCT4的3’UTR有結(jié)合能力;其中有1個(gè)(1.6%)miRNA同時(shí)為3個(gè)軟件所預(yù)測(cè),9個(gè)(14.8%)miRNA同時(shí)為2個(gè)軟件所預(yù)測(cè),51個(gè)(83.6%)僅為1個(gè)軟件所預(yù)測(cè)。構(gòu)建雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng),驗(yàn)證出20個(gè)miRNA改變了其表達(dá)的熒光素酶相對(duì)活性;通過(guò)在膀胱癌細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染mimics后的W
4、estern blot檢測(cè),結(jié)合8個(gè)miRNA與構(gòu)建的突變體驗(yàn)證結(jié)果,最終3個(gè)miRNA被確認(rèn)通過(guò)完整的篩選流程。
結(jié)論:應(yīng)用靶向OCT4的miRNA篩選流程:首先多個(gè)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè),隨后熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)驗(yàn)證,檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞后OCT4基因的表達(dá),最后構(gòu)建突變體驗(yàn)證,能高效迅速地篩選出靶向OCT4的miRNA,有較好的效價(jià)比易于在實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用開(kāi)展。
第二部分 miRNA靶向OCT4抑制膀胱癌細(xì)胞系活性與增殖
5、 目的:研究膀胱癌組織和細(xì)胞中的OCT4表達(dá)同臨床病理的聯(lián)系;研究膀胱癌細(xì)胞系轉(zhuǎn)染miRNA后生物學(xué)行為的改變,在細(xì)胞水平驗(yàn)證miRNA具體功能并探討其發(fā)生的機(jī)制
方法:應(yīng)用免疫組化和實(shí)時(shí)定量PCR,檢測(cè)膀胱癌組織中OCT4的表達(dá);將篩選出靶向結(jié)合OCT43‘UTR的miRNA分別轉(zhuǎn)染膀胱癌細(xì)胞系,觀察其靶基因OCT4的表達(dá)情況,觀察膀胱癌細(xì)胞系5637和HT-1376細(xì)胞活性MTS吸光值變化及集落形成能力的改變。
6、 結(jié)果:檢測(cè)的31例膀胱癌石蠟標(biāo)本組織中有83.9%有表達(dá),16對(duì)膀胱癌與癌旁組織中膀胱癌組織OCT4平均表達(dá)高于正常組織64倍。分別轉(zhuǎn)染miR-335、miR-4654、miR-3657后,5637和HT1376細(xì)胞中的OCT4表達(dá)下調(diào);MTS細(xì)胞活性檢測(cè)結(jié)果表明轉(zhuǎn)染miR-335、miR-4654、miR-3657后的5637細(xì)胞72小時(shí)相對(duì)吸光值A(chǔ)492分別為1.20±0.04、1.10±0.03、0.96±0.03與NC對(duì)照組1
7、.43±0.05相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;轉(zhuǎn)染miR-335、miR-4654、miR-3657后的HT-1376細(xì)胞72小時(shí)相對(duì)吸光值A(chǔ)492分別為0.85±0.02、0.71±0.02、0.62±0.03,與NC對(duì)照組1.30±0.03相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;集落形成實(shí)驗(yàn)顯示,轉(zhuǎn)染miR-335、miR-4654、miR-3657后的5637細(xì)胞按每孔1000種板培養(yǎng)10天后集落形成的數(shù)量分別為361.8±45.16、262.3±33.1
8、2、412.5±35.71,同對(duì)照組NC540.3±32.48相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;轉(zhuǎn)染miR-335、miR-4654、miR-3657后的HT-1376細(xì)胞按每孔500種板培養(yǎng)14天后集落形成的數(shù)量分別為209.5±31.78、171.3±19.76、206.3±14.51,同對(duì)照組NC的304.8±16.57相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
結(jié)論:miR-335、miR-4654、miR-3657能通過(guò)靶向OCT4抑制膀胱癌細(xì)胞系
9、5637和HT-1376的細(xì)胞活性,抑制其增殖。
第三部分 miR-335靶向OCT4調(diào)控ACHN腎癌腫瘤干細(xì)胞生物學(xué)行為
目的:研究miR-335在細(xì)胞水平靶向OCT4并調(diào)控ACHN腎癌腫瘤干細(xì)胞的生物學(xué)行為
方法:以CD105為標(biāo)記物在腎癌細(xì)胞系中篩選、培養(yǎng)并鑒定出CD105+ACHN腫瘤干細(xì)胞,利用慢病毒載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染miR-335并建立細(xì)胞株。檢測(cè)細(xì)胞株的OCT4的表達(dá),觀察miR-335影響ACHN
10、 CD105+腫瘤干細(xì)胞的成球能力、細(xì)胞周期的改變,以及細(xì)胞形態(tài)及劃痕實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞遷移能力的變化。
結(jié)果:以CD105+為標(biāo)記成功篩選建立腎癌腫瘤干細(xì)胞株,檢測(cè)其干細(xì)胞表面標(biāo)志物:Sox-2/c-Myc/Nanog/OCT4/CD44/nestin/Pax2/DLK/CXCR4/Musashi均呈現(xiàn)高表達(dá),24小時(shí)和48小時(shí)順鉑處理的ACHN CD105+細(xì)胞其增殖活性明顯高于ACHN CD105-細(xì)胞;細(xì)胞周期檢測(cè)ACHN C
11、D105+相對(duì)于ACHN CD105-細(xì)胞G0期明顯延長(zhǎng)(6.3%vs2.27%)。MiR-335穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后ACHN CD105+腫瘤干細(xì)胞OCT4表達(dá)減低,部分干細(xì)胞特性隨之減弱或消失,miR-335穩(wěn)轉(zhuǎn)腫瘤干細(xì)胞株的成球能力下降,每1000細(xì)胞成球數(shù)量同ACHN CD105+細(xì)胞成球數(shù)量差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,細(xì)胞周期G0期縮短(2.9%vs6.3%),細(xì)胞形態(tài)變化細(xì)胞突起和偽足減少,劃痕實(shí)驗(yàn)中穩(wěn)轉(zhuǎn)miR-335后ACHN CD105+細(xì)
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無(wú)特殊說(shuō)明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請(qǐng)下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請(qǐng)聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶(hù)所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁(yè)內(nèi)容里面會(huì)有圖紙預(yù)覽,若沒(méi)有圖紙預(yù)覽就沒(méi)有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 眾賞文庫(kù)僅提供信息存儲(chǔ)空間,僅對(duì)用戶(hù)上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對(duì)用戶(hù)上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對(duì)任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請(qǐng)與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶(hù)因使用這些下載資源對(duì)自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- MicroRNA--145調(diào)控Klf4和Oct4對(duì)肺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響.pdf
- 干細(xì)胞因子OCT4、SOX2和HIWI在食管鱗癌中的表達(dá)及OCT4對(duì)食管癌生物學(xué)行為的影響.pdf
- 靶向MIF的siRNA對(duì)大腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響.pdf
- 過(guò)表達(dá)Oct4與Sox2基因?qū)ξ赴┘?xì)胞生物學(xué)及腫瘤學(xué)特性影響的研究.pdf
- MicroRNA-430靶向調(diào)控CXCR7對(duì)膀胱癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其機(jī)制的研究.pdf
- CENPK基因?qū)Ω伟┘?xì)胞生物學(xué)行為的影響.pdf
- 腫瘤相關(guān)抗原CHP2對(duì)卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響.pdf
- 材料表面納米修飾對(duì)細(xì)胞生物學(xué)行為影響的研究.pdf
- microRNA-181a調(diào)控KRAS的表達(dá)對(duì)宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)行為影響的研究.pdf
- 4-1BBL逆向信號(hào)對(duì)肺癌細(xì)胞及Treg細(xì)胞生物學(xué)行為的影響.pdf
- 靜電紡絲對(duì)RSC96細(xì)胞生物學(xué)行為的影響.pdf
- 泌尿系腫瘤
- HNF6對(duì)結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為影響的初步研究.pdf
- 靶向HPSE的RNA干擾對(duì)人大腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf
- 不同膽汁酸對(duì)膽管癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響
- 化學(xué)功能團(tuán)對(duì)骨肉瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響.pdf
- 沉默β-catenin表達(dá)對(duì)人胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響.pdf
- 西咪替丁對(duì)胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響.pdf
- NF-κB靶向性圈套策略對(duì)膀胱腫瘤生物學(xué)行為的影響.pdf
- HoxC6對(duì)胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及機(jī)制研究.pdf
評(píng)論
0/150
提交評(píng)論