2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語(yǔ)一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁(yè)
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文檔簡(jiǎn)介

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開(kāi)論述:
  第一部分 OCT4靶向miRNA的系統(tǒng)性篩選
  目的:從目前已知的人類(lèi)miRNA中篩選出能特定靶向結(jié)合到OCT43’UTR端,并能引起OCT4表達(dá)下調(diào)的miRNA。
  方法:應(yīng)用多種生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)OCT43’UTR的靶向miRNA,然后通過(guò)構(gòu)建OCT4-3’UTR熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)質(zhì)粒,同預(yù)測(cè)的miRNA共轉(zhuǎn)染檢測(cè)相對(duì)熒光素酶活性;隨后將篩選出的miRNA轉(zhuǎn)染膀胱癌細(xì)胞系

2、內(nèi),選擇出能下調(diào)OCT4表達(dá)的miRNA;構(gòu)建OCT43’UTR突變體熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)質(zhì)粒,同相應(yīng)的miRNA共轉(zhuǎn)染后檢測(cè)相對(duì)熒光素酶活性,得到通過(guò)結(jié)合OCT43’UTR下調(diào)OCT4表達(dá)的miRNA
  結(jié)果:應(yīng)用軟件TargetScan預(yù)測(cè)結(jié)果有7-8個(gè)堿基可配對(duì)結(jié)合,4個(gè)miRNA結(jié)合強(qiáng)度為conserved,50個(gè)miRNA結(jié)合強(qiáng)度為poorly conserved;miRDB以默認(rèn)參數(shù)對(duì)結(jié)合能力評(píng)分排序,得到7個(gè)miR

3、NA;miRanda以默認(rèn)參數(shù)預(yù)測(cè)評(píng)分,得到11個(gè)miRNA;miRWalk與Pictar軟件未得出有意義的結(jié)果。合并后預(yù)測(cè)出61個(gè)miRNA與OCT4的3’UTR有結(jié)合能力;其中有1個(gè)(1.6%)miRNA同時(shí)為3個(gè)軟件所預(yù)測(cè),9個(gè)(14.8%)miRNA同時(shí)為2個(gè)軟件所預(yù)測(cè),51個(gè)(83.6%)僅為1個(gè)軟件所預(yù)測(cè)。構(gòu)建雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng),驗(yàn)證出20個(gè)miRNA改變了其表達(dá)的熒光素酶相對(duì)活性;通過(guò)在膀胱癌細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染mimics后的W

4、estern blot檢測(cè),結(jié)合8個(gè)miRNA與構(gòu)建的突變體驗(yàn)證結(jié)果,最終3個(gè)miRNA被確認(rèn)通過(guò)完整的篩選流程。
  結(jié)論:應(yīng)用靶向OCT4的miRNA篩選流程:首先多個(gè)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè),隨后熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)驗(yàn)證,檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞后OCT4基因的表達(dá),最后構(gòu)建突變體驗(yàn)證,能高效迅速地篩選出靶向OCT4的miRNA,有較好的效價(jià)比易于在實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用開(kāi)展。
  第二部分 miRNA靶向OCT4抑制膀胱癌細(xì)胞系活性與增殖

5、  目的:研究膀胱癌組織和細(xì)胞中的OCT4表達(dá)同臨床病理的聯(lián)系;研究膀胱癌細(xì)胞系轉(zhuǎn)染miRNA后生物學(xué)行為的改變,在細(xì)胞水平驗(yàn)證miRNA具體功能并探討其發(fā)生的機(jī)制
  方法:應(yīng)用免疫組化和實(shí)時(shí)定量PCR,檢測(cè)膀胱癌組織中OCT4的表達(dá);將篩選出靶向結(jié)合OCT43‘UTR的miRNA分別轉(zhuǎn)染膀胱癌細(xì)胞系,觀察其靶基因OCT4的表達(dá)情況,觀察膀胱癌細(xì)胞系5637和HT-1376細(xì)胞活性MTS吸光值變化及集落形成能力的改變。
 

6、 結(jié)果:檢測(cè)的31例膀胱癌石蠟標(biāo)本組織中有83.9%有表達(dá),16對(duì)膀胱癌與癌旁組織中膀胱癌組織OCT4平均表達(dá)高于正常組織64倍。分別轉(zhuǎn)染miR-335、miR-4654、miR-3657后,5637和HT1376細(xì)胞中的OCT4表達(dá)下調(diào);MTS細(xì)胞活性檢測(cè)結(jié)果表明轉(zhuǎn)染miR-335、miR-4654、miR-3657后的5637細(xì)胞72小時(shí)相對(duì)吸光值A(chǔ)492分別為1.20±0.04、1.10±0.03、0.96±0.03與NC對(duì)照組1

7、.43±0.05相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;轉(zhuǎn)染miR-335、miR-4654、miR-3657后的HT-1376細(xì)胞72小時(shí)相對(duì)吸光值A(chǔ)492分別為0.85±0.02、0.71±0.02、0.62±0.03,與NC對(duì)照組1.30±0.03相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;集落形成實(shí)驗(yàn)顯示,轉(zhuǎn)染miR-335、miR-4654、miR-3657后的5637細(xì)胞按每孔1000種板培養(yǎng)10天后集落形成的數(shù)量分別為361.8±45.16、262.3±33.1

8、2、412.5±35.71,同對(duì)照組NC540.3±32.48相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;轉(zhuǎn)染miR-335、miR-4654、miR-3657后的HT-1376細(xì)胞按每孔500種板培養(yǎng)14天后集落形成的數(shù)量分別為209.5±31.78、171.3±19.76、206.3±14.51,同對(duì)照組NC的304.8±16.57相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
  結(jié)論:miR-335、miR-4654、miR-3657能通過(guò)靶向OCT4抑制膀胱癌細(xì)胞系

9、5637和HT-1376的細(xì)胞活性,抑制其增殖。
  第三部分 miR-335靶向OCT4調(diào)控ACHN腎癌腫瘤干細(xì)胞生物學(xué)行為
  目的:研究miR-335在細(xì)胞水平靶向OCT4并調(diào)控ACHN腎癌腫瘤干細(xì)胞的生物學(xué)行為
  方法:以CD105為標(biāo)記物在腎癌細(xì)胞系中篩選、培養(yǎng)并鑒定出CD105+ACHN腫瘤干細(xì)胞,利用慢病毒載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染miR-335并建立細(xì)胞株。檢測(cè)細(xì)胞株的OCT4的表達(dá),觀察miR-335影響ACHN

10、 CD105+腫瘤干細(xì)胞的成球能力、細(xì)胞周期的改變,以及細(xì)胞形態(tài)及劃痕實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞遷移能力的變化。
  結(jié)果:以CD105+為標(biāo)記成功篩選建立腎癌腫瘤干細(xì)胞株,檢測(cè)其干細(xì)胞表面標(biāo)志物:Sox-2/c-Myc/Nanog/OCT4/CD44/nestin/Pax2/DLK/CXCR4/Musashi均呈現(xiàn)高表達(dá),24小時(shí)和48小時(shí)順鉑處理的ACHN CD105+細(xì)胞其增殖活性明顯高于ACHN CD105-細(xì)胞;細(xì)胞周期檢測(cè)ACHN C

11、D105+相對(duì)于ACHN CD105-細(xì)胞G0期明顯延長(zhǎng)(6.3%vs2.27%)。MiR-335穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后ACHN CD105+腫瘤干細(xì)胞OCT4表達(dá)減低,部分干細(xì)胞特性隨之減弱或消失,miR-335穩(wěn)轉(zhuǎn)腫瘤干細(xì)胞株的成球能力下降,每1000細(xì)胞成球數(shù)量同ACHN CD105+細(xì)胞成球數(shù)量差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,細(xì)胞周期G0期縮短(2.9%vs6.3%),細(xì)胞形態(tài)變化細(xì)胞突起和偽足減少,劃痕實(shí)驗(yàn)中穩(wěn)轉(zhuǎn)miR-335后ACHN CD105+細(xì)

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