補(bǔ)腎法、疏肝法提高IVF-ET患者卵母細(xì)胞質(zhì)量與顆粒細(xì)胞BMPs及其Smads信號(hào)通路的關(guān)系.pdf

1、我國(guó)不孕癥發(fā)病率為7％-10％，其中卵巢因素占女性不孕的25％-35％。體外受精-胚胎移植(invitrofertilization-embryotransfer,IVF-ET)是目前治療不孕癥的主要手段之一，為不孕癥患者帶來了生育新生命的希望。但卵巢功能下降，促排卵時(shí)卵巢反應(yīng)性差，獲得的卵母細(xì)胞少且質(zhì)量下降，助孕后妊娠率低下且流產(chǎn)率高。可見，卵母細(xì)胞的質(zhì)量對(duì)于受精、胚胎發(fā)育和妊娠的建立以及胎兒的發(fā)育具有深刻的影響。
　　 卵母

2、細(xì)胞質(zhì)量研究在IVF-ET技術(shù)工作中具有重要意義。IVF-ET中超過80％的胚胎著床失敗，為了提高妊娠率，目前廣泛應(yīng)用的是多胚胎移植技術(shù)，因此多胎妊娠率較自然妊娠明顯增多，而多胎妊娠增加出生的新生兒早產(chǎn)、死產(chǎn)、低出生體重、出生缺陷及妊娠期高血壓疾病等并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)。因此，提高卵母細(xì)胞質(zhì)量和胚胎質(zhì)量對(duì)提高IVF妊娠率和孕育健康子代具有重大意義。
　　 卵母細(xì)胞能通過自身分泌的因子即卵母細(xì)胞分泌因子(Oocytesecretedfac

3、tors，OSFs)調(diào)節(jié)自身的成熟，并影響周圍顆粒細(xì)胞、卵泡膜細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的功能。骨形態(tài)發(fā)生蛋白-15(Bonemorphogeneticprotein-15，BMP-15)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白-6(Bonemorphogeneticprotein-6，BMP-6)都是OSFs成員。它們是卵母細(xì)胞分泌的糖蛋白，屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforminggrowthfactorβ，TGF-β)超家族。在卵泡發(fā)育過程及早期胚胎中持續(xù)表達(dá)。研

4、究發(fā)現(xiàn)它們具有調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞的增殖分裂、卵丘擴(kuò)展及卵泡膜細(xì)胞分化，抑制顆粒細(xì)胞凋亡等功能，對(duì)維持卵巢內(nèi)健康卵泡的發(fā)育有重要作用。
　　 在TGF-β超家族的Smads信號(hào)通路中，BMP-15和BMP-6是配體，需與受體結(jié)合才能發(fā)揮作用。BMP-15和BMP-6分別與Ⅰ型受體和Ⅱ型受體結(jié)合，形成磷酸化復(fù)合物，引起下游信號(hào)分子活化調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。BMP-15的膜受體是ALK6和BMPRII，BMP-6膜受體是ALK2、ALK6和BM

5、PRII。它們結(jié)合膜受體后，共同激活受體后的Smads信號(hào)通路，即受體結(jié)合型Smad1/5/8磷酸化與Smad4結(jié)合轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。那么，BMP-15和BMP-6是否能提高卵母細(xì)胞質(zhì)量，其提高卵母細(xì)胞質(zhì)量的作用是否與Smads信號(hào)通路有關(guān)值得研究。
　　 近年來，中藥提高卵母細(xì)胞和胚胎質(zhì)量以及妊娠結(jié)局的研究有很大進(jìn)展。許多研究報(bào)道中藥可以提高卵母細(xì)胞質(zhì)量和提高卵巢儲(chǔ)備功能，并從顆粒細(xì)胞凋亡、卵泡液代謝組學(xué)、卵泡

6、液離子濃度及卵巢血流等探討了中藥提高卵母細(xì)胞質(zhì)量的作用機(jī)制。但目前尚未見中藥提高卵母細(xì)胞質(zhì)量與卵泡液及顆粒細(xì)胞卵母細(xì)胞分泌因子關(guān)系方面的研究。
　　 臨床上補(bǔ)腎法、疏肝法是治療月經(jīng)病、不孕癥的常用治法，并且療效肯定。課題組的前期研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎法、疏肝法都具有調(diào)節(jié)卵巢功能、改善妊娠結(jié)局的作用。那么，補(bǔ)腎法和疏肝法提高卵母細(xì)胞質(zhì)量與卵泡液生殖激素和顆粒細(xì)胞BMP-15、BMP-6及其Smads信號(hào)通路的關(guān)系值得探討。
　　

7、 因此，本課題擬從以下五個(gè)方面開展研究:(1)補(bǔ)腎法、疏肝法對(duì)IVF-ET患者卵母細(xì)胞質(zhì)量和妊娠結(jié)局的影響;(2)補(bǔ)腎法、疏肝法對(duì)IVF-ET患者卵泡液生殖激素的影響;(3)補(bǔ)腎法、疏肝法對(duì)IVF-ET患者卵巢顆粒細(xì)胞BMP-15表達(dá)的影響;(4)補(bǔ)腎法、疏肝法對(duì)IVF-ET患者卵巢顆粒細(xì)胞BMP-6表達(dá)的影響;(5)補(bǔ)腎法、疏肝法IVF-ET患者顆粒細(xì)胞BMP-15、BMP-6的膜受體及受體后信號(hào)通路的影響。通過上述五個(gè)方面的研究，探

8、討補(bǔ)腎法和疏肝法提高卵母細(xì)胞質(zhì)量與卵泡液生殖激素和顆粒細(xì)胞BMP-15、BMP-6及其Smads信號(hào)通路的關(guān)系，以期揭示補(bǔ)腎法、疏肝法改善生殖功能的作用機(jī)制，這對(duì)于闡釋中醫(yī)調(diào)經(jīng)種子的作用機(jī)制、豐富和完善中醫(yī)生殖理論具有重要的意義。
　　 第一部分:補(bǔ)腎法、疏肝法對(duì)IVF-ET患者卵母細(xì)胞質(zhì)量和妊娠結(jié)局的影響
　　 目的:探討補(bǔ)腎法、疏肝法對(duì)接受IVF-ET助孕的不孕癥患者促性腺激素用量、HCG日血清性激素濃度、獲卵率、受

9、精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、臨床妊娠率的影響，并比較兩法的作用有何異同。
　　 方法:選取符合納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)的接受IVF-ET助孕的不孕癥患者40例為治療組，其中符合腎虛型診斷標(biāo)準(zhǔn)的20例為補(bǔ)腎藥物組，口服補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方。符合肝郁型診斷標(biāo)準(zhǔn)的20例為疏肝藥物組，口服逍遙散方。另選同期接受符合納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)接受IVF-ET助孕的患者40例作為對(duì)照組。比較各組的年齡、不孕年限、基礎(chǔ)性激素濃度、促性腺激素用量、HCG注射日血清E2、

10、LH、P濃度、獲卵數(shù)、受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率和臨床妊娠率。
　　 結(jié)果:1.補(bǔ)腎藥物組、疏肝藥物組和對(duì)照組患者一般資料比較:各組之間患者年齡、不孕年限、基礎(chǔ)性FSH組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);2.補(bǔ)腎藥物組、疏肝藥物組和對(duì)照組促性腺激素用量和HCG注射日血清E2、LH、P濃度比較:與對(duì)照組相比，補(bǔ)腎藥物組和疏肝藥物組HCG注射日血清E2、LH、P濃度組間無顯著性差異(P＞0.05)。補(bǔ)腎藥物組和疏肝藥物組相比，HCG注射日

11、血清E2、LH、P濃度組間無顯著性差異(P＞0.05)。補(bǔ)腎藥物組、疏肝藥物組和對(duì)照組促性腺激素用量比較，與對(duì)照組相比，補(bǔ)腎藥物組低于對(duì)照組有顯著性差異(P＜0.05)，疏肝藥物組低于對(duì)照組有顯著性差異(P＜0.05)，補(bǔ)腎藥物組與疏肝藥物組比較差異無顯著性(P＞0.05)。3.補(bǔ)腎藥物組、疏肝藥物組和對(duì)照組獲卵數(shù)、受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率和臨床妊娠率的比較:與對(duì)照組相比，補(bǔ)腎藥物組和疏肝藥物組獲卵數(shù)和受精率組間無顯著性差異(P＞0.05);

12、補(bǔ)腎藥物組和疏肝藥物組相比，獲卵數(shù)和受精率組間無顯著性差異(P＞0.05)。補(bǔ)腎藥物組、疏肝藥物組和對(duì)照組優(yōu)質(zhì)胚胎率比較:與對(duì)照組相比，補(bǔ)腎藥物組高于對(duì)照組，有顯著性差異(P＜0.05);疏肝藥物組高于對(duì)照組，有顯著性差異(P＜0.05);補(bǔ)腎藥物組高于疏肝藥物組，但是差異無顯著性。補(bǔ)腎藥物組、疏肝藥物組和對(duì)照組臨床妊娠率比較:與對(duì)照組比較，補(bǔ)腎藥物組和疏肝藥物組臨床妊娠率有增高的趨勢(shì)，但無顯著性差異(P＞0.05)，補(bǔ)腎藥物組和疏肝藥

13、物組比較，補(bǔ)腎組略高于疏肝組，但無顯著性差異(P＞0.05)。4.妊娠組與未妊娠組患者一般資料比較:進(jìn)一步將各組患者分為妊娠組與未妊娠組進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)兩組之間年齡、不孕年限、基礎(chǔ)FSH水平、促性腺激素用量和HCG注射日血清E2、LH、P濃度獲卵數(shù)、受精率的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);而優(yōu)質(zhì)胚胎率妊娠組高于未妊娠組，其差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。
　　 小結(jié):本部分結(jié)果發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎法、疏肝法都有增加優(yōu)質(zhì)胚胎率、降

14、低促性腺激素用量的作用。而優(yōu)質(zhì)胚胎率是最常用的卵母細(xì)胞及胚胎質(zhì)量的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，據(jù)此認(rèn)為補(bǔ)腎法和疏肝法都有提高卵母細(xì)胞質(zhì)量的作用。
　　 第二部分:補(bǔ)腎法、疏肝法對(duì)IVF-ET患者卵泡液生殖激素的影響
　　 目的:通過觀察補(bǔ)腎藥物和疏肝藥物對(duì)IVF-ET患者卵泡液生殖激素的影響，研究補(bǔ)腎法和疏肝法提高卵母細(xì)胞質(zhì)量與卵泡液生殖激素的關(guān)系。
　　 方法:采用化學(xué)發(fā)光微粒子免疫法測(cè)定卵泡液中FSH、LH、E2、T、P濃度。

15、
　　 結(jié)果:1.對(duì)照組、補(bǔ)腎藥物組和疏肝藥物組卵泡液中FSH、LH、E2、T、P濃度組間比較:與對(duì)照組相比，補(bǔ)腎藥物組、疏肝藥物組卵泡液FSH濃度均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。補(bǔ)腎藥物組與疏肝藥物組之間卵泡液FSH濃度比較無顯著性差異(P＞0.05)。與對(duì)照組相比，補(bǔ)腎藥物組卵泡液LH濃度明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。疏肝藥物組與對(duì)照組之間和補(bǔ)腎藥物組與疏肝藥物組之間卵泡液LH濃度比較無顯著性差

16、異(P＞0.05)。與對(duì)照組相比，補(bǔ)腎藥物組和疏肝藥物組卵泡液E2濃度均增高，但差異無顯著性(P＞0.05);補(bǔ)腎藥物組與疏肝藥物組卵泡液E2濃度比較無顯著性差異(P＞0.05)。與對(duì)照組相比，補(bǔ)腎藥物組和疏肝藥物組卵泡液T濃度增高，但差異無顯著性(P＞0.05);補(bǔ)腎藥物組與疏肝藥物組卵泡液T濃度比較無無顯著性差異(P＞0.05)。與對(duì)照組相比，補(bǔ)腎藥物組卵泡液P濃度比較無無顯著性差異(P＞0.05);疏肝藥物組卵泡液P濃度明顯增高，

17、差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);疏肝藥物組卵泡液P濃度明顯高于補(bǔ)腎藥物組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。2.妊娠組與未妊娠組卵泡液中FSH、LH、E2、T、P濃度比較:進(jìn)一步將各組患者分為妊娠組與未妊娠組進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)兩組之間卵泡液FSH、E2、T和P濃度比較均無顯著性差別(P＞0.05);妊娠組卵泡液LH濃度明顯高于未妊娠組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 小結(jié):補(bǔ)腎法和疏肝法卵泡液中FSH的濃度的較低，與降低

18、的促性腺激素藥物用量及增強(qiáng)卵巢反應(yīng)性有關(guān)。補(bǔ)腎法可提高卵泡液中LH的濃度，疏肝法可提高卵泡液中P的濃度，這可能是補(bǔ)腎法和疏肝法提高卵母細(xì)胞質(zhì)量的作用途徑之一。并且補(bǔ)腎法和疏肝法的作用機(jī)制不同。
　　 第三部分:補(bǔ)腎法、疏肝法對(duì)IVF-ET患者卵巢顆粒細(xì)胞BMP-15表達(dá)的影響
　　 目的:通過觀察補(bǔ)腎藥物和疏肝藥物對(duì)IVF-ET患者卵巢顆粒細(xì)胞BMP-15mRNA及其蛋白表達(dá)的影響，研究補(bǔ)腎法和疏肝法提高卵母細(xì)胞質(zhì)量與調(diào)

19、控卵巢顆粒細(xì)胞BMP-15表達(dá)的關(guān)系。
　　 方法:采用Real-TimePCR(Real-TimeReverseTranscriptionPCR)、細(xì)胞免疫熒光法和Westernblot方法檢測(cè)顆粒細(xì)胞上BMP-15mRNA及其蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果:1.Real-TimePCR法檢測(cè)各組卵巢顆粒細(xì)胞上BMP-15mRNA的表達(dá):各組顆粒細(xì)胞上都有BMP-15mRNA的表達(dá)。與對(duì)照組相比，補(bǔ)腎藥物組、疏肝藥物BMP-

20、15mRNA的表達(dá)均增高，有顯著性差異(P＜0.01)。補(bǔ)腎藥物組和疏肝藥物組之間比較無顯著性差異(P＞0.05)。
　　 2.細(xì)胞免疫化學(xué)發(fā)光法觀察各組卵巢顆粒細(xì)胞上BMP-15蛋白的表達(dá):各組顆粒細(xì)胞上都有BMP-15蛋白的表達(dá)。在激光共聚焦熒光顯微鏡下可觀察到特異性的綠色點(diǎn)狀熒光分布。與對(duì)照組相比，補(bǔ)腎藥物組和疏肝藥物組BMP-15蛋白的表達(dá)均增高，有顯著性差異(P＜0.01);補(bǔ)腎藥物組和疏肝藥物組之間比較無顯著性差異(

21、P＞0.05)。3.Westernblot法觀察各組卵巢顆粒細(xì)胞上BMP-15蛋白表達(dá):各組顆粒細(xì)胞上都有BMP-15蛋白的表達(dá)。與對(duì)照組相比，補(bǔ)腎藥物組和疏肝藥物組均增高，有顯著性差異(P＜0.05)。補(bǔ)腎藥物組和疏肝藥物組之間比較無顯著性差異(P＞0.05)。
　　 4.進(jìn)一步將對(duì)照組患者分為妊娠組與未妊娠組進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)兩組之間妊娠組BMP-15mRNA的表達(dá)高于未妊娠組，有顯著性差異(P＜0.05)。細(xì)胞免疫熒光法、We

22、sternblot法檢測(cè)BMP-15蛋白的表達(dá)妊娠組均高于未妊娠組，均有顯著性差異(P＜0.05，P＜0.01)。
　　 小結(jié):補(bǔ)腎法和疏肝法均可上調(diào)IVF-ET患者顆粒細(xì)胞上BMP-15的表達(dá)，并且妊娠組BMP-15表達(dá)高于未妊娠組，因此補(bǔ)腎法和疏肝法可以通過促進(jìn)顆粒細(xì)胞上BMP-15的表達(dá)提高卵母細(xì)胞質(zhì)量。推測(cè)在卵泡發(fā)育的過程中補(bǔ)腎法和疏肝法上調(diào)BMP-15表達(dá)而促進(jìn)顆粒細(xì)胞的有絲分裂和增殖，從而促進(jìn)卵母細(xì)胞發(fā)育。
　

23、　 第四部分:補(bǔ)腎法、疏肝法對(duì)IVF-ET患者卵巢顆粒細(xì)胞BMP-6表達(dá)的影響
　　 目的:通過觀察補(bǔ)腎藥物和疏肝藥物對(duì)IVF-ET患者卵泡液中BMP-6蛋白表達(dá)及卵巢顆粒細(xì)胞BMP-6mRNA和蛋白表達(dá)的影響，探討補(bǔ)腎法、疏肝法提高卵母細(xì)胞質(zhì)量與卵巢顆粒細(xì)胞BMP-6表達(dá)的關(guān)系。
　　 方法:采用Westemblot方法檢測(cè)卵泡液BMP-6蛋白的表達(dá);Real-TimePCR、細(xì)胞免疫熒光法和Westernblot方

24、法檢測(cè)顆粒細(xì)胞上BMP-6mRNA和蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果:1.Westernblot法檢測(cè)卵泡液中BMP-6蛋白表達(dá):各組卵泡液都檢測(cè)出BMP-6蛋白。與對(duì)照組相比，補(bǔ)腎藥物組BMP-6蛋白表達(dá)明顯增高有顯著性差異，(P＜0.05)。疏肝藥物組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。補(bǔ)腎藥物組和疏肝藥物組相比，補(bǔ)腎藥物組卵泡液中BMP-6蛋白表達(dá)明顯高于疏肝藥物組，有顯著性差異(P＜0.01)。2.Real-TimePCR法檢測(cè)顆

25、粒細(xì)胞上BMP-6mRNA表達(dá):各組顆粒細(xì)胞上都有BMP-6mRNA的表達(dá)。與對(duì)照組相比，補(bǔ)腎藥物組顆粒細(xì)胞上BMP-6mRNA表達(dá)明顯增高，有顯著性差異(P＜0.01)。疏肝藥物組差異無顯著性(P＞0.05)。補(bǔ)腎藥物組顆粒細(xì)胞上BMP-6mRNA表達(dá)明顯高于疏肝藥物組，有顯著性差異(P＜0.01)。3.細(xì)胞免疫化學(xué)發(fā)光法觀察顆粒細(xì)胞上BMP-6蛋白表達(dá):各組顆粒細(xì)胞上都有BMP-6蛋白的表達(dá)。在激光共聚焦熒光顯微鏡下可觀察到特異性的

26、綠色點(diǎn)狀熒光分布。與對(duì)照組相比，補(bǔ)腎藥物組顆粒細(xì)胞上BMP-6蛋白表達(dá)明顯增高，有顯著性差異(P＜0.05);疏肝藥物組無顯著性差異(P＞0.05)。補(bǔ)腎藥物組和疏肝藥物組顆粒細(xì)胞上BMP-6蛋白表達(dá)無顯著性差異(P＞0.05)。4.Westernblot法觀察顆粒細(xì)胞上BMP-6蛋白表達(dá):各組顆粒細(xì)胞上都有BMP-6蛋白的表達(dá)。與對(duì)照組相比，補(bǔ)腎藥物組BMP-6蛋白表達(dá)明顯增高，有顯著性差異(P＜0.05);疏肝藥物組無顯著性差異，(

27、P＞0.05)。補(bǔ)腎藥物組和疏肝藥物組BMP-6蛋白表達(dá)相比，無顯著性差異(P＞0.05)。5.進(jìn)一步將對(duì)照組患者分為妊娠組與未妊娠組進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)兩組之間妊娠組卵泡液BMP-6蛋白表達(dá)明顯高于未妊娠組，差異有顯著性(P＜0.01)。妊娠組顆粒細(xì)胞BMP-6mRNA的表達(dá)明顯高于未妊娠組，差異有顯著性(P＜0.05)。細(xì)胞免疫熒光法和Westernblot法觀察BMP-6蛋白表達(dá):妊娠組高于未妊娠組，差異有顯著性(P＜0.05）。

28、>　　 小結(jié):補(bǔ)腎法可明顯增加卵泡液及顆粒細(xì)胞中BMP-6mRNA及其蛋白的表達(dá)，提示補(bǔ)腎法提高卵母細(xì)胞質(zhì)量的作用可能與上調(diào)卵泡液及顆粒細(xì)胞中BMP-6的表達(dá)有關(guān)，而疏肝法對(duì)卵泡液及顆粒細(xì)胞BMP-6的表達(dá)無明顯影響。補(bǔ)腎法和疏肝法提高卵母細(xì)胞質(zhì)量的作用機(jī)制有同有異。同時(shí)發(fā)現(xiàn)妊娠組卵泡液及顆粒細(xì)胞BMP-6表達(dá)均明顯高于未妊娠組。首次證明了BMP-6在卵母細(xì)胞發(fā)育、促進(jìn)妊娠的過程中發(fā)揮重要作用。
　　 第五部分補(bǔ)腎法、疏肝法對(duì)

29、IVF-ET患者顆粒細(xì)胞BMP-15、BMP-6的膜受體及受體后信號(hào)通路的影響
　　 目的:通過觀察補(bǔ)腎藥物和疏肝藥物對(duì)IVF-ET患者卵巢顆粒細(xì)胞BMP-15、BMP-6膜受體及受體后信號(hào)通路的影響，探討補(bǔ)腎法、疏肝法提高卵母細(xì)胞質(zhì)量與卵巢顆粒細(xì)胞Smads信號(hào)通路的關(guān)系。
　　 方法:采用Real-TimePCR、細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)顆粒細(xì)胞上ALK2、ALK6、BMPRII、Smad1、Smad5、Smad8和Sma

30、d4mRNA及其蛋白的表達(dá);Westernblot方法檢測(cè)顆粒細(xì)胞上Smad1的表達(dá)。
　　 結(jié)果:1.Real-TimePCR法檢測(cè)顆粒細(xì)胞上膜受體ALK2、ALK6、BMPRIImRNA的表達(dá):各組顆粒細(xì)胞上膜受體ALK2、ALK6、BMPRIImRNA均有表達(dá)，三組之間比較均無顯著性差異(P＞0.05)。2.細(xì)胞免疫熒光法觀察顆粒細(xì)胞上膜受體ALK2、ALK6、BMPRII的表達(dá):各組顆粒細(xì)胞上都有ALK2、ALK6、BM

31、PRII蛋白的表達(dá)，在激光共聚焦熒光顯微鏡下可觀察到特異性的綠色點(diǎn)狀熒光分布。三組之間比較均無顯著性差異(P＞0.05)。3.Real-TimePCR法檢測(cè)顆粒細(xì)胞上Smad1、Smad5、Smad8和Smad4mRNA的表達(dá):各組顆粒細(xì)胞上均有Smad1、Smad5、Smad8和Smad4mRNA的表達(dá)。與對(duì)照組相比，補(bǔ)腎藥物組Smad1mRNA明顯增高，差異有顯著性(P＜0.05)。疏肝藥物組無顯著性差異(P＞0.05)。補(bǔ)腎藥物組

32、Smad1mRNA高于疏肝藥物組，差異有顯著性（P＜0.05）。Smad5、Smad8和Smad4mRNA三組之間比較均無顯著性差異(P＞0.05)。4.細(xì)胞免疫熒光法觀察顆粒細(xì)胞上Smad1、Smad5、Smad8和Smad4的表達(dá):各組顆粒細(xì)胞上都有Smad1、Smad5、Smad8和Smad4蛋白的表達(dá)，在激光共聚焦熒光顯微鏡下可觀察到特異性的綠色點(diǎn)狀熒光分布。與對(duì)照組相比，補(bǔ)腎藥物組Smad1蛋白表達(dá)明顯增高于，差異有顯著性(P

33、＜0.05)。疏肝藥物組差異無顯著性(P＞0.05)。補(bǔ)腎藥物組Smad1蛋白表達(dá)高于疏肝藥物組，有顯著性差異(P＜0.05)。Smad5、Smad8和Smad4蛋白表達(dá)三組之間比較均無顯著性差異(P＞0.05)。5.Westernblot檢測(cè)顆粒細(xì)胞上Smad1蛋白表達(dá):與對(duì)照組相比，補(bǔ)腎藥物組Smad1蛋白表達(dá)明顯增高于對(duì)照組，差異有顯著性(P＜0.05)。疏肝藥物組無顯著性差異(P＞0.05)。補(bǔ)腎藥物組Smad1蛋白表達(dá)高于疏肝

34、藥物組，差異有顯著性(P＜0.05)。6.進(jìn)一步將對(duì)照組患者分為妊娠組與未妊娠組進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)兩組之間顆粒細(xì)胞上膜受體ALK2、ALK6、BMPRII和Smad1、Smad5、Smad8和Smad4mRNA和蛋白的表達(dá)，差異無顯著性(P＞0.05)。
　　 小結(jié):補(bǔ)腎法和疏肝法對(duì)顆粒細(xì)胞BMPs的膜受體ALK2、ALK6、BMPRII的表達(dá)均無影響;對(duì)顆粒細(xì)胞Smad5、Smad8和Smad4的表達(dá)均無影響。但是補(bǔ)腎法可以上調(diào)S

35、mad1表達(dá)，Smad1表達(dá)增加可以增強(qiáng)上游細(xì)胞因子的作用，這可能是補(bǔ)腎法提高卵子質(zhì)量作用的途徑之一，而疏肝法無此作用。
　　 結(jié)論:補(bǔ)腎法、疏肝法均有增加優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)及降低促性腺激素用量的作用。提示補(bǔ)腎法和疏肝法均可提高卵母細(xì)胞質(zhì)量作用。BMP-6在妊娠組卵泡液及顆粒細(xì)胞的表達(dá)均明顯高于未妊娠組。首次證實(shí)了BMP-6在卵子發(fā)育、促進(jìn)妊娠的過程中發(fā)揮重要作用。補(bǔ)腎法和疏肝法均可降低卵泡液中FSH的濃度，進(jìn)而減少促性腺激素藥物的用量