鈣粘蛋白：A549細胞、HUVEC細胞的煙曲霉重要受體.pdf

1、隨著免疫抑制人群的不斷增加，機會感染的發(fā)病率急劇上升。機會感染中真菌感染死亡率高、治療昂貴而困難，預后極差。對于移植患者來說，曲霉感染在機會真菌感染中占主要地位。移植患者中侵襲性曲霉病病死率高達60％-80％左右，嚴重威脅患者生命。即使及時、合理的使用抗真菌藥物，侵襲性曲霉病的治療有效率仍僅50％-70％左右。目前曲霉病中最重要的致病原為煙曲霉，占發(fā)病率的90％左右。煙曲霉是一種在廣泛分布于自然界的腐生菌。正常人每天吸入煙曲霉的孢子量很

2、多但并不發(fā)病，因為肺部功能強大吞噬細胞有效的清除了這些致病原；但免疫抑制患者的吞噬細胞功能受損，而未被吞噬的曲霉孢子就可能侵襲肺泡上皮，最后進入肺組織造成感染，侵入組織的曲霉發(fā)育成菌絲，菌絲侵襲血管、穿透內(nèi)皮細胞可造成曲霉特征性病變—組織梗死和全身播散。可以看出煙曲霉侵襲宿主細胞是致病的重要環(huán)節(jié)，特別是探討煙曲霉與肺泡上皮細胞、血管內(nèi)皮細胞的相互作用不僅可以研究曲霉的致病機理，抑或可為治療尋找新的靶點。
　　 煙曲霉粘附、侵襲細

3、胞可能涉及相當多的分子，包括粘附分子、模式識別分子等。較早的體外實驗用纖維蛋白素原(fibrinogen)預處理煙曲霉的孢子，其粘附于肺泡上皮細胞(A549)的能力下降30％-50％。孢子并可以直接粘附于層連蛋白(1aminin)、膠原(collagen)、纖連蛋白(fibronectin)。但其后相關的研究甚少。病原體如何粘附、侵襲非吞噬宿主細胞在一些微生物上有一定的研究。白色假絲酵母菌侵襲非吞噬細胞中研究得比較透徹，宿主細胞膜蛋白中

4、的cadherin(鈣粘蛋白)在白色假絲酵母菌進入宿主細胞過程中其關鍵作用。Cadherin是一類依賴于鈣離子的細胞間粘附分子，能和其他相關的粘附分子結(jié)合介導細胞粘附。白色假絲酵母菌表面的凝集素同源物als3存在特定的B折疊結(jié)構，并能與上皮細胞、內(nèi)皮細胞表達cadherin結(jié)合后介導白色假絲酵母菌進入宿主細胞。類似的產(chǎn)單核細胞李斯特菌細胞膜上的internalin A其膜外特定的富亮氨酸重復序列(Leucine rich repeat

5、domain，LRR)也形成特定的β折疊結(jié)構與上皮表面的cadherin膜外結(jié)構結(jié)合而介導病原侵入宿主細胞。人肺泡上皮細胞也有E-cadherin(epithelial-type cadherin E鈣粘蛋白)、內(nèi)皮細胞有N-cadherin(neuron-typecadherin N鈣粘蛋白)的表達；而念珠菌與煙曲霉同屬真菌界，其胞膜也可能存在同源的蛋白。因此我們設想cadherin可能在煙曲霉侵襲上皮細胞時也起重要作用。因此本實驗擬

6、研究肺泡上皮細胞表達的E-cadherin、內(nèi)皮細胞的N-cadherin是否在煙曲霉侵襲過程中也起特定的作用。
　　 第一部分E-cadherin為肺泡上皮細胞粘附、吞噬煙曲霉孢子的重要受體
　　 目的：探討E-cadherin在煙曲霉孢子粘附、侵襲肺泡上皮細胞(A549)過程中的作用。
　　 方法：(1)體外培養(yǎng)A549細胞，提取A549總蛋白。與煙曲霉孢子共孵育，通過離心去除未與孢子結(jié)合的蛋白。EDTA解離

7、與孢子結(jié)合的蛋白，Western-blot檢測是否有E-cadherin的存在；免疫熒光法檢測孢子表面是否存在E-cadherin。(2)熒光染色法建立A549粘附、吞噬煙曲霉孢子的體外模型，通過抗體阻斷法、SiRNA下調(diào)A549細胞膜蛋白E-cadherin，觀察A549粘附、吞噬煙曲霉孢子的能力的變化。(3)觀察A549細胞膜蛋白E-cadherin是否隨煙曲霉孢子侵入上皮細胞而變化。
　　 結(jié)果：(1)A549的膜蛋白E-

8、cadherin可以與煙曲霉孢子結(jié)合；(2)100個A549細胞粘附吞噬的煙曲霉孢子數(shù)在1、2、4小時分別為204±12、212±12.5、209±7.5；加入0.2mM EDTA后1小時粘附吞噬的孢子數(shù)為141±5.5，再加入鈣離子后A549粘附吞噬的孢子數(shù)為218±17；而加入同濃度的鎂離子后A549粘附吞噬的孢子數(shù)為147±5.5。在培養(yǎng)液中預先加入的1∶50、1∶100、1∶200的E-cadherin抗體，100個A549粘附

9、吞噬的煙曲霉孢子數(shù)為161.7±8.5、163.7±8.5、163±12。E-cadherin的SiRNA處理的A549細胞粘附吞噬的孢子數(shù)為167.67±9.5，聯(lián)合1∶50抗體處理后粘附吞噬的孢子數(shù)為141.3±9.6。(3)Western-blot檢測發(fā)現(xiàn)A549在粘附吞噬煙曲霉孢子0、1、2、4小時E-cadherin的表達無明顯改變。24小時10-7M的地塞米松處理A54924小時E-cadherin的表達無明顯改變。

10、　　 結(jié)論：E-cadherin在人肺泡上皮細胞(A549)粘附、吞噬煙曲霉孢子的過程中起重要作用。
　　 第二部分N-cadherin為人臍靜脈內(nèi)皮細胞粘附、吞噬煙曲霉菌絲的重要受體
　　 目的：探討N-cadherin在HUVEC粘附、吞噬煙曲霉菌絲過程中的作用。
　　 方法：(1)體外培養(yǎng)HUVEC細胞，提取總蛋白。與煙曲霉菌絲共孵育，通過離心去除未與孢子結(jié)合的蛋白。EDTA解離與菌絲結(jié)合的蛋白，West

11、ern-blot檢測是否有N-cadherin的存在；免疫熒光法檢測孢子表面是否存在N-cadherin。(2)熒光染色法建立HUVEC粘附、吞噬煙曲霉菌絲的體外模型，通過抗體阻斷細胞膜蛋白N-cadherin，觀察HUVEC粘附、吞噬煙曲霉的能力的變化。(3)觀察HUVEC細胞膜蛋白N-cadherin是否隨煙曲霉孢子侵入上皮細胞而變化。(4)免疫熒光觀察N-cadherin的定位是否與煙曲霉相關。
　　 結(jié)果：(1)HUVE

12、C的膜蛋白可以與煙曲霉菌絲結(jié)合。(2)正常HUEC在1小時后粘附吞噬煙曲霉菌絲為235±9.2，加入0.2mM EDTA后1小時粘附吞噬的菌絲數(shù)為126.3±11.6，再加入鈣離子后粘附吞噬的菌絲數(shù)為239±24；而加入同濃度的鎂離子后A549粘附吞噬的孢子數(shù)為137±18.4。在培養(yǎng)液中預先加入的1∶50、1∶100、1∶200的N-cadherin抗體，100個HUVEC粘附吞噬的煙曲霉數(shù)為133.3±23、148±13、171±1