小檗堿類化合物降糖作用的活性、機(jī)理與化學(xué)基礎(chǔ).pdf

1、小檗堿(berberine，BBR)的降糖作用已在二型糖尿病病人中得以證實(shí)。機(jī)制研究表明，BBR激活肌肉和肝等胰島素敏感細(xì)胞內(nèi)的AMPK(AMP-activatedproteinkinase)，AMPK通過不依賴胰島素的信號通路，增加肌肉組織對葡萄糖的攝取，減少肝臟的糖異生，從而引起機(jī)體血糖的下降。本研究發(fā)現(xiàn)，BBR激活包括MRC-5（人胚肺細(xì)胞），Caco-2（人結(jié)直腸癌細(xì)胞），HCT-116（人結(jié)直腸癌細(xì)胞），PC-3（人前列腺癌細(xì)

2、胞），HL-7702（人肝細(xì)胞），BEL-7402（人肝癌細(xì)胞）和HepG2（人肝癌細(xì)胞）在內(nèi)的多種細(xì)胞中的AMPK，激活作用可被AMPK的抑制劑CompoundC(CC)所抑制。BBR激活A(yù)MPK的機(jī)制可能與其抑制細(xì)胞線粒體的電子傳遞有關(guān)。BBR增加人肝細(xì)胞HL-7702和HepG2，以及嚙齒動物肌肉細(xì)胞L6和C2C12的糖消耗量；但BBR增加糖消耗的作用不能被CC抑制，也不受干擾RNA介導(dǎo)的AMPK表達(dá)下調(diào)的影響；說明細(xì)胞內(nèi)可能存在

3、其它的蛋白或機(jī)制具有和AMPK及其調(diào)控通路類似的作用，此問題將在下文中詳細(xì)闡述。葡萄糖消耗量能夠直觀地反映細(xì)胞對葡萄糖利用的情況，本研究采用了這一指標(biāo)衡量BBR等化合物的體外降糖效果。
　　 因此，本文設(shè)計(jì)構(gòu)建了分別針對AMPK活性和糖消耗量的細(xì)胞篩選模型，用以評價BBR結(jié)構(gòu)類似物的體外降糖活性。本項(xiàng)目通過化學(xué)修飾和改造，得到42個BBR的結(jié)構(gòu)類似物；分別使用上述兩種篩選模型進(jìn)行評價。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，化合物M2B1雖然激活A(yù)MPK的作

4、用比BBR強(qiáng)，但具有毒性。在糖耗量篩選中，BBR的活性最強(qiáng)；T-1-2、J-70和470三個化合物糖消耗的活性與BBR接近，分別是BBR的87％，85%和87%，目前正在進(jìn)行深入的研究。本文分析了BBR衍生物增加細(xì)胞糖消耗量的構(gòu)效關(guān)系，為BBR進(jìn)一步的化學(xué)改造提供了研究基礎(chǔ)。
　　 異小檗堿（isoberberine，開發(fā)后命名為IMB-Y53，以下簡稱Y-53）也是上述衍生物中的一個，結(jié)構(gòu)上是BBR的同分異構(gòu)體。本室前期研究發(fā)

5、現(xiàn)，Y-53在實(shí)驗(yàn)動物中口服安全性好，且降脂作用優(yōu)于BBR。本研究首次報(bào)道，Y-53也具有降糖作用。細(xì)胞水平上，Y-53可以時間和劑量依賴性的激活肌肉細(xì)胞L6和C2C12中的AMPK;Y-53對AMPK的激活作用可以被CompoundC抑制；Y-53增加肝和肌肉細(xì)胞的糖消耗，但活性不能被CompoundC抑制；Y-53的體外作用與BBR是一致的，但活性弱于BBR。在KK-Ay二型糖尿病小鼠模型中，使用100mg/kg/day的Y-53治

6、療使小鼠血糖下降28%，與使用300mg/kg/day二甲雙胍(metformin)治療的效果相當(dāng)（血糖下降30%）；兩種藥物都降低了肥胖小鼠的體重（Y-53組降低10.6%，metformin組降低11.4%）；同時，Y-53使肥胖小鼠的膽固醇和甘油三酯水平分別下降了11%和44%，而二甲雙胍沒有這些作用；結(jié)果提示，BBR類化合物應(yīng)用于代謝調(diào)控具有其特殊的優(yōu)勢。Y-53體外增加糖消耗的能力僅為BBR的50-63%，但在db/db二型糖

7、尿病小鼠模型中，Y-53的降糖效果卻與BBR相當(dāng)，甚至略優(yōu)于BBR，其機(jī)理主要是增加了生物利用度（已由本室的另一位博士完成）。
　　 如上文所述，BBR的降糖作用可能并不依賴于AMPK。本研究室的前期工作表明，BBR使細(xì)胞內(nèi)PKD的916位絲氨酸自磷酸化而激活，進(jìn)而促進(jìn)胰島素受體(insulinreceptor，InsR)基因的轉(zhuǎn)錄，增加InsR在細(xì)胞膜上的表達(dá)，從而提高二型糖尿病病人的胰島素敏感性，降低病人的血糖。本研究發(fā)現(xiàn)，

8、BBR和Y-53治療組db/db糖尿病小鼠的肝和骨骼肌中，AMPK被激活，同時InsR的表達(dá)普遍升高。因此，InsR介導(dǎo)的胰島素通路可能是BBR和Y-53發(fā)揮降糖作用的另一條重要途徑，Y-53和BBR的降糖機(jī)制可能與它們調(diào)控胰島素信號通路和AMPK信號通路都有關(guān)。
　　 除了上述的BBR衍生物，本文還進(jìn)一步研究了BBR的代謝產(chǎn)物對上述BBR作用靶點(diǎn)(LDLR、InsR、AMPK)和糖消耗量的生物學(xué)活性。人體內(nèi)BBR經(jīng)一相代謝產(chǎn)生

9、4個主要的代謝產(chǎn)物M1～M4。為探討B(tài)BR的代謝調(diào)控作用是BBR自身的作用還是這些代謝產(chǎn)物的作用，本研究比較了BBR與4個代謝產(chǎn)物對上述靶點(diǎn)和葡萄糖消耗量的活性強(qiáng)度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)物M1～M4都可以增加HepG2細(xì)胞內(nèi)InsR的表達(dá)；M1和M2可以增加HepG2細(xì)胞內(nèi)低密度脂蛋白受體(lowdensitylipoproteinreceptor，LDLR)的表達(dá)，M3和M4沒有作用；M1和M2可以激活HepG2細(xì)胞內(nèi)的AMPK，而M1～M4

10、都可以激活大鼠骨骼肌L6細(xì)胞中的AMPK;四種代謝產(chǎn)物都可以增加肌肉細(xì)胞L6和C2C12對葡萄糖的消耗；對于上述靶點(diǎn)和生物學(xué)效應(yīng)，代謝產(chǎn)物的作用強(qiáng)度都不如BBR本身，所以發(fā)揮代謝調(diào)控作用的主要化學(xué)實(shí)體是BBR本身，而不是其代謝產(chǎn)物。另外，代謝產(chǎn)物的生物活性雖然都不如BBR，但它們的結(jié)構(gòu)中具有可被修飾的羥基（如圖15所示），可以在化學(xué)改造中加以利用。
　　 BBR的生物利用度較低（不足5%）。近幾年本研究小組嘗試多種手段提高BBR

11、的體內(nèi)藥效。理論上，增加口服生物利用度可能提高BBR降糖的效果。前藥制備是提高藥物生物利用度的重要手段之一，但BBR的結(jié)構(gòu)不易改造成前藥，所以我們決定挑選有活性的BBR代謝產(chǎn)物進(jìn)行前藥合成，來探討增加生物利用度能否提高BBR類化合物的體內(nèi)藥效。由于結(jié)構(gòu)中E環(huán)開放的產(chǎn)物M3和M4（結(jié)構(gòu)如圖15所示），在HepG2細(xì)胞中喪失了對AMPK和LDLR的藥效（如圖16.B和C所示），因此被放棄。如上文所述，盡管弱于BBR，但產(chǎn)物M1保持了所有BB

12、R的生物學(xué)活性，且對于LDLR的活性優(yōu)于其它代謝產(chǎn)物；因此，本文最終選取了M1作為活性基團(tuán)進(jìn)行前藥合成與評價。
　　 本研究發(fā)現(xiàn)，將代謝產(chǎn)物M1的9位羥基棕櫚酸化，得到的前藥化合物5g，具有較好的脂溶性(2＜LogP＜7)和血漿酯酶水解速率；前藥5g長期給藥不影響大鼠的肝腎功能，表明其具有良好的安全性；在二型糖尿病模型小鼠KK-Ay上,5g具有和BBR相當(dāng)?shù)慕堤切Ч?00mg/kg/day的5g治療組血糖下降26%，100mg

13、/kg/day的BBR治療組血糖下降28%）。從不同細(xì)胞的糖消耗量上看，M1的生物活性僅為BBR的15-46%，但制成前藥增加脂溶性及生物利用度后,5g與BBR在動物水平的降糖效果相當(dāng)。這說明，增加生物利用度可以提高BBR類化合物的體內(nèi)藥效，這為BBR的改造提供了研究方向。另外，化合物5g需要進(jìn)入血液才能大量釋放出有效成分M1，提示BBR類化合物需要進(jìn)入血液才能發(fā)揮代謝調(diào)控作用。
　　 綜上所述，本研究表明BBR可在體內(nèi)和體外激

14、活A(yù)MPK，但其降糖作用可能并不依賴于AMPK。針對抑制線粒體電子傳遞發(fā)揮作用的降糖藥物（如BBR和二甲雙胍），本研究構(gòu)建了細(xì)胞水平測定葡萄糖消耗量的篩選模型，分析總結(jié)了BBR類似物對細(xì)胞糖消耗量的構(gòu)效關(guān)系，為BBR的化學(xué)改造提供了理論基礎(chǔ)。本研究首次證實(shí)了Y-53的降糖作用，與BBR相同，Y-53也具有同時調(diào)控血糖和血脂的優(yōu)點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)，BBR四個主要一相代謝產(chǎn)物(M1～M4)的生物學(xué)活性不如BBR；因此，發(fā)揮代謝調(diào)控作用的主要化學(xué)