高氧誘導(dǎo)新生鼠視網(wǎng)膜VEGF及TNF－α的表達與地塞米松的干預(yù)研究.pdf

1、作為世界范圍內(nèi)兒童致盲的重要原因之一，早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病(ROP)一直是大家關(guān)注的焦點，多發(fā)生于早產(chǎn)兒和低體重兒中，是一種視網(wǎng)膜血管增生性病變。ROP的發(fā)病原因與早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜本身血管的發(fā)育不完全有關(guān)，當(dāng)視網(wǎng)膜因多種原因形成新生血管以及伴有纖維化時，即出現(xiàn)增殖性視網(wǎng)膜病變，嚴(yán)重者可發(fā)生牽引性視網(wǎng)膜脫離，所以研究新生血管的發(fā)生機制近年來成為學(xué)界重點關(guān)注的方向，預(yù)防及治療早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病的研究切入點是如何抑制視網(wǎng)膜新生血管的形成。
　　早產(chǎn)兒

2、視網(wǎng)膜病的嚴(yán)重并發(fā)癥是因視網(wǎng)膜血管的異常增生引起，而視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞的增殖受視網(wǎng)膜血管形成刺激因子和血管形成抑制因子的共同調(diào)控，達到一種平衡狀態(tài)，該狀態(tài)一旦被打破，即可啟動新生血管生長。國外研究發(fā)現(xiàn)新生血管的生長多是由于上調(diào)血管促進因子或下調(diào)血管抑制因子所致，而這些因子主要包括有血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、色素上皮衍生因子（PEDF）等。其中VEGF占據(jù)著至關(guān)重要的地位，無論在正?；蛘弋惓顟B(tài)下對于血

3、管的形成均具有重要作用，在視網(wǎng)膜血管正常發(fā)育以及成熟過程中VEGF起著促進作用，在ROP病變中視網(wǎng)膜血管質(zhì)和量的變化可以推測是由于VEGF在視網(wǎng)膜表達水平的變化所引起。除了VEGF外，TNF—α作為另外一種重要的血管誘導(dǎo)因子，在炎癥、細胞凋亡和血管形成過程中也發(fā)揮著重要作用。因此，視網(wǎng)膜新生血管抑制因子療法已成為具有頗大研究前景的ROP診治方法之一。
　　近年來國內(nèi)外均有報道地塞米松用于一些視網(wǎng)膜疾病如急性前葡萄膜炎、視網(wǎng)膜沖擊傷

4、、增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病及角膜堿燒傷等的治療。目前臨床上廣泛產(chǎn)前應(yīng)用糖皮質(zhì)激素地塞米松促進胎肺成熟，而地塞米松對于早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變的發(fā)生發(fā)展有何影響及其作用機制國內(nèi)外尚缺乏令人信服的實驗依據(jù)。
　　目的：
　　模擬早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病(retinopathy of prematurity，ROP)的病理特點，建立高氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病的新生鼠模型，為研究ROP的發(fā)病機制及治療方法提供實驗基礎(chǔ)。觀察地塞米松對高氧誘導(dǎo)小鼠視網(wǎng)膜新生血管的形成

5、有何影響，探討地塞米松對新生血管形成是否存在抑制作用及其可能的作用機制，并研究不同劑量下地塞米松對ROP的影響，為地塞米松可能影響早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病的發(fā)生發(fā)展提供實驗依據(jù)。
　　方法：
　　一、高氧誘導(dǎo)新生鼠視網(wǎng)膜血管增生模型的建立：選擇7曰齡C57BL/6J新生小鼠58只，分為單純高氧誘導(dǎo)組和對照組，將29只單純高氧誘導(dǎo)組小鼠置于特制密閉容器（內(nèi)環(huán)境控制在氧濃度為75％）中飼養(yǎng)5天，隨后放回至正常空氣環(huán)境下飼養(yǎng)，17日齡時處死

6、；另29只對照組小鼠持續(xù)在正?？諝猸h(huán)境中生長到17日齡。兩組新生鼠在鼠齡分別為P12(生后第12天)、P14時各處死8只，其余的在P17時處死，處死前稱重。兩組視網(wǎng)膜鋪片ADP酶染色后，比較視網(wǎng)膜血管形態(tài)、走向及分布上的差異；兩組視網(wǎng)膜切片HE染色后，觀察并計數(shù)突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細胞核數(shù)目，從而定量反映視網(wǎng)膜血管的增生情況。
　　二、地塞米松影響鼠視網(wǎng)膜新生血管生成和VEGF、TNF—α表達的研究：建立高氧大劑量地塞米松組

7、、高氧小劑量地塞米松組、高氧對照組及評價組，每組小鼠各15只。在P12、P14和P17時稱重，并于17日齡時處死。各組視網(wǎng)膜鋪片經(jīng)ADP酶染色后，觀察視網(wǎng)膜血管的改變；視網(wǎng)膜病理切片HE染色后，計數(shù)突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的新生血管內(nèi)皮細胞核數(shù)目；VEGF蛋白及TNF—α蛋白在各組小鼠視網(wǎng)膜中表達的強度及分布。
　　結(jié)果：
　　一、高氧誘導(dǎo)新生鼠視網(wǎng)膜血管增生模型的建立：
　　1.對照組在P17時視網(wǎng)膜血管的發(fā)育大致趨向成熟，

8、血管網(wǎng)結(jié)構(gòu)清晰，由視盤發(fā)出的大血管呈放射狀，向四周均勻分布散開，管徑逐漸由粗變細直至視網(wǎng)膜周邊部，未見血管閉塞。單純高氧誘導(dǎo)組在P17時由視盤發(fā)出的視網(wǎng)膜血管出現(xiàn)明顯擴張、迂曲，在中周部可見較多新生血管，這些血管的密度增高，血管網(wǎng)的結(jié)構(gòu)和分布均比較紊亂，大片無灌注區(qū)存在于后極部視網(wǎng)膜。
　　2.對照組未發(fā)現(xiàn)或僅在非常少數(shù)的切片中發(fā)現(xiàn)有突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜血管內(nèi)皮細胞核，而單純高氧誘導(dǎo)組可見較多突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細胞核，有的單獨

9、出現(xiàn)，有的成簇狀，有的形成新生血管管腔；高氧誘導(dǎo)組內(nèi)突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細胞核數(shù)P14、P17分別與P12比較均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），而兩組比較在P12時無差異，在P14、P17時差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。
　　3.單純高氧誘導(dǎo)組在P17時新生鼠視網(wǎng)膜切片中新生血管內(nèi)皮細胞核數(shù)左右眼相比較無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　二、地塞米松影響鼠視網(wǎng)膜新生血管生成和VEGF、TNF—α表達的研究：
　　1. ADP酶

10、染色：大、小劑量地塞米松組視網(wǎng)膜血管形態(tài)與高氧對照組相比
　　明顯正常，更接近正常對照組的血管形態(tài)，無灌注區(qū)明顯縮小，新生血管不明顯，說明兩組不同劑量的地塞米松對新生血管的生長均有明顯抑制作用。評價組的視網(wǎng)膜血管與對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明地塞米松對正常血管的生長抑制作用不明顯。
　　2.HE染色：兩組不同劑量地塞米松組眼組織切片中僅見少量突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細胞核，高氧對照組所有切片均可見突破內(nèi)界膜的內(nèi)皮細胞

11、核，與高氧誘導(dǎo)組相類似。各組鏡下觀察突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細胞核數(shù)，大、小劑量地塞米松組分別和高氧對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。但地塞米松不同劑量組之間比較，P>0.05，兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　3.免疫組化分析：在P17時，對照組VEGF蛋白主要在視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層、神經(jīng)節(jié)細胞層、色素上皮層（RPE層）呈弱陽性表達；TNF—α蛋白也呈弱陽性，陽性信號主要分布于內(nèi)核層、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞層。單純高氧誘導(dǎo)組和高氧對照組VEGF

12、蛋白及TNF—α蛋白均呈強陽性表達，其中VEGF蛋白在視網(wǎng)膜各層均有表達，而TNF—α蛋白則主要分布于新生血管內(nèi)皮細胞、內(nèi)界膜層、神經(jīng)節(jié)細胞層和內(nèi)核層。大、小劑量地塞米松組中VEGF及TNF—α的表達較單純高氧誘導(dǎo)組明顯減弱。
　　4.大、小劑量地塞米松組與對照組相比較，在P7時體重?zé)o明顯差異，而在P12、P17時體重差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　1.成功建立了ROP的小鼠模型，為進一步研究藥物治療早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜

13、病提供了比較合適的動物模型。
　　2.在高氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變的小鼠模型中，VEGF蛋白、TNF—α蛋白在視網(wǎng)膜上的表達增強，作為氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變的重要血管影響因子，它們的表達與視網(wǎng)膜血管新生有著密切的關(guān)系。
　　3.地塞米松對視網(wǎng)膜新生血管的形成可能有抑制作用，影響高氧誘導(dǎo)新生鼠視網(wǎng)膜新生血管生成過程，對視網(wǎng)膜起著一定的保護作用。
　　4.地塞米松影響視網(wǎng)膜新生血管形成的作用機制可能與其抑制了視網(wǎng)膜VEGF蛋白及TNF—