不同補(bǔ)碘劑量對(duì)碘缺乏大鼠的甲狀腺?gòu)?fù)原的影響.pdf

1、目的：甲狀腺細(xì)胞可以產(chǎn)生大量的活性氧(reactive oxygen species,ROS),ROS是合成甲狀腺激素的必需物質(zhì)。但當(dāng)ROS產(chǎn)生過(guò)多時(shí),就會(huì)產(chǎn)生毒性,對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和大分子物質(zhì)造成損傷。研究發(fā)現(xiàn)給碘缺乏的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物補(bǔ)碘會(huì)產(chǎn)生毒性作用,碘誘導(dǎo)甲狀腺?gòu)?fù)原的大鼠的甲狀腺中氧化應(yīng)激顯著增強(qiáng),導(dǎo)致甲狀腺細(xì)胞破壞和炎癥反應(yīng)。甲狀腺中存在多種抗氧化劑,包括超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物、過(guò)氧化物氧化還原蛋白(peroxired

2、oxins,PRDXs)、硫氧化蛋白還原酶(thioredoxin reductase,TrxR)和維生素E(VE)等,VE作為抗氧化劑可以清除自由基,中斷脂質(zhì)過(guò)氧化的鏈?zhǔn)椒磻?yīng),VE對(duì)甲狀腺細(xì)胞的細(xì)胞膜有很強(qiáng)的保護(hù)作用,正常大鼠甲狀腺和肝臟中VE的濃度相同,而碘缺乏大鼠甲狀腺中VE濃度是肝臟中的兩倍,這些提示當(dāng)甲狀腺中氧化應(yīng)激增強(qiáng)后VE的表達(dá)量顯著增加。
　　 本研究中采用VE來(lái)拮抗小劑量碘誘導(dǎo)的甲狀腺損傷。通過(guò)研究缺碘甲腫和碘

3、誘導(dǎo)甲腫復(fù)原大鼠的氧化應(yīng)激、抗氧化劑表達(dá)以及超微結(jié)構(gòu)改變,來(lái)檢測(cè)VE對(duì)碘誘導(dǎo)的甲狀腺細(xì)胞毒性的潛在保護(hù)作用,以及最佳補(bǔ)充VE劑量。
　　 方法：選擇4周齡雌性Wistar大鼠,隨機(jī)分為對(duì)照組(Control)、缺碘組(LI)、缺碘2倍補(bǔ)碘組(LI-2I)、缺碘補(bǔ)碘補(bǔ)VE組(LI-2I+25VE/50VE/100VE)。Control組飲含碘194μg/L碘水,食低碘飼料;LI組飲去離子水,食低碘飼料12周,進(jìn)行低碘甲腫造模;LI

4、-2I組在低碘甲腫造模成功后給予飲含碘470.7μg/L碘水,食低碘飼料;LI-2I+-25VE/50VE/100VE組在低碘甲腫造模成功后給予飲含碘470.7gg/L碘水,食含25倍/50倍/100倍VE的低碘飼料,于補(bǔ)碘4周時(shí)麻醉處死各組動(dòng)物。留取大鼠甲狀腺組織,HE染色觀察形態(tài)學(xué)變化,透射電鏡觀察甲狀腺細(xì)胞超微結(jié)構(gòu),免疫組化染色觀察4-羥基壬烯醛(4-HNE)、8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷(8-OHdG)、過(guò)氧化物氧化還原蛋白(PRDX5)、

5、硫氧還蛋白還原酶-1(TrxR-1)、CD68(單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)的標(biāo)記物)表達(dá)變化。
　　 應(yīng)用SPSS17.0軟件處理和分析數(shù)據(jù)。參數(shù)計(jì)量資料:以mcan±SD表示,兩組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),方差齊同的多組比較采用單因素方差分析(ANOVA),方差不齊時(shí)使用非參數(shù)檢驗(yàn)。
　　 結(jié)果：
　　 1、低碘組甲狀腺存在超微結(jié)構(gòu)損傷,缺碘2倍補(bǔ)碘組甲狀腺超微結(jié)構(gòu)損傷較低碘組加重,缺碘2倍補(bǔ)碘補(bǔ)VE組甲狀腺超微結(jié)構(gòu)

6、損傷較單純2倍補(bǔ)碘組明顯減輕,50倍VE組超微結(jié)構(gòu)損傷最輕。
　　 2、與對(duì)照組比,缺碘2倍補(bǔ)碘組中脂質(zhì)過(guò)氧損傷指標(biāo)4-HNE表達(dá)量顯著增加(P＜0.05);缺碘補(bǔ)碘25倍和50倍補(bǔ)充VE組中4-HNE表達(dá)量明顯下降(P＜0.05),而缺碘補(bǔ)碘100倍補(bǔ)VE組中4-HNE表達(dá)量與單純2倍補(bǔ)碘組沒(méi)有差異;與對(duì)照組比缺碘2倍補(bǔ)碘組中脂質(zhì)過(guò)氧損傷指標(biāo)8-OHdG表達(dá)量顯著增加(P＜0.05)；缺碘補(bǔ)碘補(bǔ)充VE組中8-OHdG表達(dá)量明顯

7、下降(P＜0.05)。
　　 3、與對(duì)照組比,缺碘2倍補(bǔ)碘組中抗氧化酶TrxR-1表達(dá)量顯著下降(P＜0.05),缺碘補(bǔ)碘補(bǔ)VE組中TrxR-1的表達(dá)量較單純補(bǔ)碘組明顯增多(P＜0.05)。
　　 4、與對(duì)照組比,缺碘2倍補(bǔ)碘組和低碘組中PRDX5的表達(dá)量明顯增高(P＜0.05),后者增高程度高于前者,缺碘后補(bǔ)碘補(bǔ)VE組中PRDX5的表達(dá)量較單純補(bǔ)碘組明顯下降(P＜0.05),50倍VE組PRDX5下降最明顯。
　

8、　 5、與對(duì)照組比,低碘組和缺碘2倍補(bǔ)碘組中CD68染色陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)量明顯增多(P＜0.05),缺碘2倍補(bǔ)碘組增加更為明顯,缺碘補(bǔ)碘補(bǔ)VE組中CD68染色陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)量較單純補(bǔ)碘組明顯減少(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1、長(zhǎng)期給予2倍補(bǔ)碘,可以誘導(dǎo)缺碘甲狀腺?gòu)?fù)原,導(dǎo)致碘誘導(dǎo)的甲狀腺細(xì)胞毒性。
　　 2、強(qiáng)烈的氧化應(yīng)激可能對(duì)碘誘導(dǎo)的甲狀腺細(xì)胞毒性起到重要作用。
　　 3、50倍VE可能是拮抗碘誘

9、導(dǎo)的甲狀腺細(xì)胞毒性的最佳劑量。
　　 目的：甲狀腺是自由基產(chǎn)生和清除十分活躍的器官,正常情況下甲狀腺組織中H2O2的產(chǎn)生和清除處于動(dòng)態(tài)平衡,但是如果甲狀腺內(nèi)氧化應(yīng)激過(guò)強(qiáng),超過(guò)生理劑量的H2O2和其它活性氧族(ROS)引起的氧化應(yīng)激就會(huì)影響甲狀腺細(xì)胞正常生理功能。研究發(fā)現(xiàn)給碘缺乏的動(dòng)物補(bǔ)碘后,甲狀腺中氧化應(yīng)激增強(qiáng),對(duì)甲狀腺產(chǎn)生毒性作用,補(bǔ)碘并不能完全逆轉(zhuǎn)甲狀腺缺碘時(shí)的形態(tài)學(xué)改變,補(bǔ)碘后甲狀腺相對(duì)重量未恢復(fù)正常,甲狀腺由于缺碘造成的

10、超微結(jié)構(gòu)損傷在補(bǔ)碘后不但沒(méi)有減輕,反而隨著補(bǔ)碘劑量的增加而加重。有研究發(fā)現(xiàn)缺碘大鼠補(bǔ)碘同時(shí)給予補(bǔ)充抗氧化劑--硒或維生素E(VE),可以部分拮抗碘誘導(dǎo)的甲狀腺細(xì)胞毒性。TSH受體(TSHR)主要調(diào)節(jié)甲狀腺的分化和功能,下游調(diào)控元件拮抗劑調(diào)節(jié)子(downstream regulatoryelement antagonistic modulator,DREAM)可以調(diào)節(jié)TSHR活性,過(guò)表達(dá)DREAM的轉(zhuǎn)基因鼠的甲狀腺顯著腫大。
　　

11、 本課題擬建立Wistar大鼠缺碘甲狀腺腫模型,模擬前期流行病學(xué)研究中人群的碘營(yíng)養(yǎng)狀態(tài),給予缺碘大鼠1倍、3倍和6倍補(bǔ)碘,并且在補(bǔ)碘同時(shí)給予補(bǔ)充硒或VE,觀察不同劑量補(bǔ)碘同時(shí)加/不加抗氧化劑對(duì)缺碘甲狀腺?gòu)?fù)原的影響,并對(duì)兩種抗氧化劑的效果進(jìn)行比較,探求一條更為合理的補(bǔ)碘方案,為防止碘缺乏病提供新思路;同時(shí)對(duì)甲狀腺形態(tài)學(xué)未能完全復(fù)原的機(jī)制進(jìn)行探討。
　　 方法：
　　 4周齡雌性Wistar大鼠,隨機(jī)分為對(duì)照組(Contro

12、l)、缺碘組(LI)、缺碘補(bǔ)碘組(LI-1I/3I/6I)、缺碘補(bǔ)碘5倍補(bǔ)Se組(LI-1I/3I/6I+5Se)、缺碘補(bǔ)碘50倍補(bǔ)VE組(LI-1I/3I/6I+50VE)、缺碘1倍補(bǔ)碘補(bǔ)L-T4組(LI-1I+T4)和缺碘補(bǔ)L-T4組(LI-T4)。Control組飲含碘194μg/L碘水,食低碘飼料;LI組飲去離子水,食低碘飼料16周,進(jìn)行低碘甲腫造模;LI-1I/3I/6I組在低碘甲腫造模成功后給予飲含碘194μg/L、748μ

13、g/L、1578μg/L碘水,食低碘飼料;LI-1I/3I/6I+5Se組在低碘甲腫造模成功后分別給予飲含碘194μg/L、748μg/L、1578μg/L,含硒940μg/L的水,食低碘飼料,LI-II/31/6I+50VE組在低碘甲腫造模成功后給予飲含碘194μg/L、748μg/L、1578μg/L的水,食含50倍VE的低碘飼料,LI-1I+T4組在低碘甲腫造模成功后給予飲含碘194μg/L的水,每日皮下注射L-T4(1.0μg/

14、100g體重),LI-T4組在低碘甲腫造模成功后給予每日皮下注射L-T4(1.0μg/100g體重),食低碘飼料。分別于補(bǔ)碘1周和10周時(shí)麻醉處死各組動(dòng)物。稱量大鼠體重和甲狀腺重量,觀察甲狀腺相對(duì)重量變化;電感耦合等離子體質(zhì)譜儀檢測(cè)血清硒水平;留取大鼠甲狀腺組織HE染色觀察形態(tài)學(xué)變化;透射電鏡觀察甲狀腺細(xì)胞超微結(jié)構(gòu):免疫組化染色觀察4-羥基壬烯醛(4-HNE)、8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷(8-OHdG)和CD68表達(dá)變化;Western blot

15、檢測(cè)過(guò)氧化物氧化還原蛋白5(PRDX5)、硫氧化蛋白還原酶-1(TrxR-1)、DREAM、PCNA;組織勻漿檢測(cè)谷胱甘肽過(guò)氧化物(Gpx)活性。
　　 應(yīng)用SPSS17.0軟件處理和分析數(shù)據(jù)。參數(shù)計(jì)量資料:以mean±SD表示,兩組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),方差齊同的多組比較采用單因素方差分析(ANOVA),方差不齊時(shí)使用非參數(shù)檢驗(yàn)。
　　 結(jié)果：
　　 1、補(bǔ)硒后,各補(bǔ)碘補(bǔ)硒組大鼠血硒濃度明顯升高,在補(bǔ)硒各時(shí)點(diǎn)

16、均顯著高于相應(yīng)補(bǔ)碘組及對(duì)照組(P＜0.05)。
　　 2、與對(duì)照組和缺碘組比單純補(bǔ)碘組中各時(shí)點(diǎn)4-HNE和8-OHdG表達(dá)量均顯著增加(P＜0.05);補(bǔ)碘10周時(shí),補(bǔ)碘補(bǔ)硒組和補(bǔ)碘補(bǔ)VE組中4-HNE和8-OHdG的表達(dá)量均較單純補(bǔ)碘組明顯下降(P＜0.05),補(bǔ)碘1周時(shí),補(bǔ)碘補(bǔ)VE組中4-HNE的表達(dá)量少于補(bǔ)碘補(bǔ)硒組。
　　 3、補(bǔ)碘10周時(shí),與對(duì)照組比,缺碘補(bǔ)碘組中抗氧化酶TrxR-1表達(dá)量顯著下降(P＜0.05)

17、,補(bǔ)碘補(bǔ)硒組和補(bǔ)碘補(bǔ)VE組中TrxR-1的表達(dá)量較單純補(bǔ)碘組明顯增多(P＜0.05);與對(duì)照組比,缺碘補(bǔ)碘組和缺碘組中各時(shí)點(diǎn)PRDX5的表達(dá)量明顯增高(P＜0.05),后者增高程度高于前者,補(bǔ)碘10周時(shí),補(bǔ)碘補(bǔ)硒組和補(bǔ)碘補(bǔ)VE組中PRDX5的表達(dá)量較單純補(bǔ)碘組明顯下降(P＜0.05);補(bǔ)碘10周時(shí),各補(bǔ)硒組甲狀腺中Gpx的活性顯著高于單純補(bǔ)碘組(P＜0.05)。
　　 4、與對(duì)照組比,低碘組和缺碘補(bǔ)碘組中CD68染色陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)

18、量明顯增多(P＜0.05),缺碘補(bǔ)碘補(bǔ)硒組和缺碘補(bǔ)碘補(bǔ)VE組中,各時(shí)點(diǎn)CD68染色陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)量較單純補(bǔ)碘組明顯減少(P＜0.05)。
　　 5、補(bǔ)碘1周和10周時(shí),單純補(bǔ)碘組、補(bǔ)碘補(bǔ)硒組和補(bǔ)碘補(bǔ)VE組以及缺碘1倍補(bǔ)碘補(bǔ)T4和缺碘補(bǔ)T4組中甲狀腺相對(duì)重量均較缺碘組顯著下降(P＜0.05),補(bǔ)碘第1周甲狀腺相對(duì)重量快速下降,兩個(gè)補(bǔ)T4組的甲狀腺相對(duì)重量下降速度最快,之后甲狀腺相對(duì)重量下降速度比較緩慢,10周,各復(fù)原組中甲狀腺相對(duì)重

19、量無(wú)差異,但都高于對(duì)照組。
　　 6、低碘組甲狀腺存在超微結(jié)構(gòu)損傷,缺碘補(bǔ)碘組甲狀腺超微結(jié)構(gòu)損傷較低碘組加重,并且隨著補(bǔ)碘劑量的增加而加重,補(bǔ)碘10周時(shí)的損傷程度重于補(bǔ)碘1周;補(bǔ)碘補(bǔ)硒組和補(bǔ)碘補(bǔ)VE組以及缺碘1倍補(bǔ)碘補(bǔ)T4和缺碘補(bǔ)T4組中甲狀腺超微結(jié)構(gòu)損傷較單純補(bǔ)碘組明顯減輕。
　　 7、補(bǔ)碘1周時(shí),各甲狀腺?gòu)?fù)原組中DREAM的表達(dá)量顯著低于缺碘組,但高于對(duì)照組組:補(bǔ)碘10周時(shí),DREAM的表達(dá)量下降更為明顯,與對(duì)照組比

20、差別不顯著。
　　 8、補(bǔ)碘1周和10周時(shí),缺碘組中PCNA的表達(dá)量明顯高于對(duì)照組(P＜0.05),各個(gè)甲腫復(fù)原組中PCNA的表達(dá)量較低碘組明顯下降,與補(bǔ)碘1周時(shí)比,補(bǔ)碘10周時(shí)PCNA的表達(dá)量進(jìn)一步下降,但仍然高于對(duì)照組。
　　 結(jié)論：
　　 1、1倍、3倍和6倍補(bǔ)碘可以導(dǎo)致缺碘甲狀腺發(fā)生碘誘導(dǎo)的甲狀腺細(xì)胞毒性,其強(qiáng)度隨補(bǔ)碘劑量的增加而增加。
　　 2、5倍硒或50倍VE通過(guò)增加甲狀腺中抗氧化酶的表達(dá)或

21、活性來(lái)部分拮抗碘誘導(dǎo)的甲狀腺細(xì)胞毒性,從而減輕炎癥反應(yīng),促進(jìn)甲狀腺?gòu)?fù)原。
　　 3、VE可以在早期拮抗補(bǔ)碘引起的脂質(zhì)過(guò)氧化損傷,長(zhǎng)期補(bǔ)充硒或VE對(duì)碘誘導(dǎo)的甲狀腺細(xì)胞毒性的拮抗作用沒(méi)有顯著差異。
　　 4、缺碘補(bǔ)碘同時(shí)補(bǔ)充5倍硒或50倍VE與甲狀腺重量和相對(duì)重量的恢復(fù)無(wú)關(guān)。
　　 5、雖然DREAM蛋白表達(dá)增多可以導(dǎo)致甲狀腺腫大,但是補(bǔ)碘后甲狀腺未能恢復(fù)到正常狀態(tài)不是通過(guò)DREAM蛋白通路介導(dǎo)的。
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