重組人硫氧還蛋白1 cDNA的克隆、表達、多克隆抗體制備以及對內(nèi)毒素血癥新生大鼠保護作用的初步研究.pdf

1、研究背景:
　　 內(nèi)毒素血癥(endotoxemia，ETM)是由于體內(nèi)革蘭氏陰性細菌釋放出大量內(nèi)毒素，侵入血液循環(huán)而引起的一系列病理生理反應(yīng)，是引起全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemicinflammatoryresponsesyndrome，SIRS)和多器官功能衰竭(multipleorganfailure，MOF)的主要原因。脂多糖(LPS)是內(nèi)毒素的主要成分，來源于革蘭氏陰性菌細胞壁的外膜，由核心寡聚糖、特異性多糖與類脂

2、A組成，其中類脂A是LPS的活性部位以及毒力中心。LPS幾乎可以介導(dǎo)所有的內(nèi)毒素生物學(xué)效應(yīng)，激活機體的免疫應(yīng)答，促使機體產(chǎn)生多種炎性介質(zhì)，引發(fā)機體的全身炎癥反應(yīng)，進而影響機體屏障功能和臟器功能的完整性，嚴(yán)重時將導(dǎo)致發(fā)熱反應(yīng)、白細胞反應(yīng)以及內(nèi)毒素血癥和內(nèi)毒素休克等。
　　 嚴(yán)重感染導(dǎo)致的內(nèi)毒素血癥是引起新生兒和兒童全身炎癥反應(yīng)和死亡的主要原因之一，是臨床上常見的危重癥，其高發(fā)病率及死亡率是長期以來困擾醫(yī)學(xué)界的一大難題。在內(nèi)毒素血癥

3、及并發(fā)癥的治療方面，目前除了使用抗生素及激素等對癥處理外，仍無明顯有效的治療手段。更棘手的是，應(yīng)用抗生素后，細菌被抑制或者殺死，菌血癥雖得到有效控制，但是細菌在殺死的同時，大量的內(nèi)毒素釋放出來，體液或血漿中的內(nèi)毒素水平升高，機體免疫反應(yīng)被過度激活，內(nèi)毒素血癥病情會進一步加重。
　　 硫氧還蛋白(thioredoxin，Trx)又稱白細胞介素-1樣細胞因子、成人T細胞白血病衍化因子和早孕因子，是一種子1964年在大腸桿菌、1989

4、年在人體中分別首次發(fā)現(xiàn)的普遍存在于不同有機體的小分子蛋白。它廣泛存在于原核生物和真核生物中，其活性位點為-Cys-Gly-Pro-Cys-，通過其特有的二硫化物活性中心，可逆地催化許多氧化還原反應(yīng)。根據(jù)Trx定位，可以將其分為三種:Trx1、Trx2和Trx3。Trx1位于細胞質(zhì)中，Trx2位于線粒體中，Trx3則主要存在精子細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。
　　 Trx-1是硫氧還蛋白家族中研究最廣泛的，是在胞內(nèi)胞外均存在的多功能蛋白，它除了

5、具有基本的抗氧化功能外，還具有促生長、抗凋亡、抗炎和調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子活性等作用。近年來，國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，人硫氧還蛋白1與炎癥性疾病關(guān)系密切，目前研究較多的是其抗炎的作用以及相關(guān)機制。另外，人硫氧還蛋1通過腎臟排泄，除腎臟濃度排第一位外，肺臟的硫氧還蛋白1濃度排在第二位，這提示硫氧還蛋白或許可以成為肺部疾病的重要治療藥物。
　　 目的:
　　 制備重組人硫氧還蛋白1(recombinanthumanthioredoxin-1，

6、rhTrx-1)，用此蛋白免疫動物制備抗血清，并對抗血清的效價和特異性進行檢測，驗證其可用性。通過建立新生大鼠內(nèi)毒素血癥模型并予以rhTrx-1進行干預(yù)，初步探討該重組蛋白是否對內(nèi)毒素新生大鼠具有保護作用，為后期的實驗奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 1.rhTrx-1cDNA的獲取及引物設(shè)計:
　　 從人胎肝細胞中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。從人的cDNA文庫中篩選出hTrx-1基因，根據(jù)其編碼序列，利用DN

7、AClub軟件設(shè)計上下游引物。應(yīng)用設(shè)計的特異引物，利用高保真的DNA聚合酶進行擴增，PCR產(chǎn)物利用瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
　　 2.重組原核表達載體的構(gòu)建以及鑒定:
　　 PCR鑒定回收產(chǎn)物和PET-28a(+)載體分別用Sal(I)和Sac(I)雙酶切、回收、連接后轉(zhuǎn)入大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細胞，卡那霉素篩選陽性克隆，提取的重組質(zhì)粒進行酶切和測序鑒定。
　　 3.重組蛋白的誘導(dǎo)表達:
　　 提取PET-

8、28a(+)-hTrx-1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌BL21工程菌，卡那霉素篩選陽性克隆，挑取單菌落接種于含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)過夜并加入IPTG至濃度1mmol/l誘導(dǎo)，離心收集菌體沉淀，處理樣品后取上清進行SDS-PAGE電泳分析。
　　 4.重組蛋白的大量誘導(dǎo)和純化:
　　 根據(jù)上述的誘導(dǎo)表達方法確定最適宜的誘導(dǎo)時間，然后對陽性克隆進行大量的誘導(dǎo)表達，離心收集菌體，1×結(jié)合Buffer重懸后4℃過夜，

9、次日解凍后于冰上超聲裂解后，分別取沉淀和上清樣品處理后行SDS-PAGE蛋白電泳判斷重組蛋白的可溶性。蛋白在上清表達，去內(nèi)毒素后參照His柱蛋白純化說明書進行純化，目的蛋白透析后，Bradford法進行蛋白濃度測定，并于-80℃保存?zhèn)溆谩?br>　　 5.多克隆抗體的制備與鑒定:
　　 初次免疫時，將200μg蛋白與等體積的弗氏完全佐劑充分混合，于大鼠皮下多點免疫。隨后每隔2周，用100μg蛋白與等體積的弗氏不完全佐劑混合，進

10、行多點加強免疫，同時設(shè)立對照組及陰性對照組。每次免疫前及末次免疫兩周后大鼠尾部采血，間接ELISA法檢測抗血清效價。制備純化的rhTrx-1多克隆抗體后以Westernblot方法檢測其可用性以及特異性。
　　 6.對內(nèi)毒素新生大鼠保護作用的初步觀察:
　　 以足月新生7天SD大鼠為實驗對象，LPS5mg/kg腹腔內(nèi)注射，制備新生SD大鼠內(nèi)毒素血癥模型。36只新生7天大鼠隨機分為陰性對照組、對照組和實驗組，每組各12只，

11、陰性對照組腹腔注射0.9％生理鹽水0.1mL;對照組腹腔注射LPS5mg/kg;實驗組于LPS注射前30min腹腔注射rhTrx-1(10mg/kg)，觀察注射后24h各組新生SD大鼠的一般情況以及死亡率。重復(fù)實驗，每組分別于實驗后的2h、8h隨機處死數(shù)只，提取肺組織用于病理切片觀察。
　　 7.采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析:
　　 三組間死亡率比較采用多個樣本率的x2檢驗，P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　

12、 結(jié)果:
　　 1.原核重組質(zhì)粒的鑒定:
　　 提取原核重組質(zhì)粒，行PCR擴增和雙酶切鑒定，反應(yīng)后的產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果顯示在600bp左右有一清晰條帶，與目的基因大小基本相符。重組質(zhì)粒的測序報告顯示插入序列與理論序列完全一致，證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。
　　 2.最佳誘導(dǎo)時間:
　　 加入IPTG誘導(dǎo)劑后，目的蛋白表達增加，且隨著時間的延長，蛋白表達量增多，但4-5h未有明顯變化。
　　 3

13、.蛋白表達以及純化結(jié)果:
　　 將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌BL21中，SDS-PAGE電泳顯示，在大約27.9kDa處出現(xiàn)高效表達條帶，與目的蛋白基本相符。經(jīng)鑒定，蛋白主要存在于上清，經(jīng)過柱后得到純化蛋白，其位置與目的蛋白相符，證明目的蛋白純化成功。
　　 4.間接ELISA法檢測多克隆抗體效價:
　　 間接ELISA結(jié)果表明，蛋白免疫3次后，第6周時效價達1:51200以上。
　　 5.West

14、ernblot法檢測抗原抗體特異性結(jié)合:
　　 多克隆抗體對人硫氧還蛋白1的Westernblot結(jié)果顯示在27.9kDa處呈現(xiàn)單一清晰條帶，而正常大鼠血清對該蛋白未識別出條帶，證明抗體特異性良好。
　　 6.新生SD大鼠24h死亡率:
　　 陰性對照組活動、飲食一切正常，沒有死亡發(fā)生;對照組動物注入LPS1h后，表現(xiàn)出活動減少、離群、嗜睡、口周發(fā)紺、呼吸急促等全身炎癥反應(yīng)癥狀，瀕死狀態(tài)時表現(xiàn)為毛色青灰、呼吸淺表

15、，24h死亡率為67％(8/12);實驗組動物癥狀不明顯，24h死亡率為17％(2/12);3組間死亡率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（x2=14.400,P=0.001)。
　　 7.肺組織大體觀察:
　　 對照組腹腔注射LPS一段時間后，新生大鼠肺臟可見點狀肺出血，隨著給藥時間延長，出血程度由局灶性到彌漫性逐漸加重。與對照組相比，實驗組的新生大鼠肺臟出血程度明顯減輕。
　　 8.肺組織病理形態(tài)學(xué)觀察:
　　 陰性對

16、照組肺組織結(jié)構(gòu)完整，肺泡隔無水腫，肺泡腔清晰。對照組肺組織結(jié)構(gòu)不完整，肺泡腔內(nèi)有大量紅細胞、炎性細胞和漿液滲出，血管周圍組織可見白細胞浸潤，毛細血管有明顯充血及擴張表現(xiàn)，肺泡間隔明顯增寬。實驗組病理改變較對照組明顯減輕，肺泡結(jié)構(gòu)尚可，輕度肺水腫，肺泡間隔稍增寬，紅細胞滲出明顯減少，肺泡及肺間質(zhì)中白細胞浸潤減少。
　　 結(jié)論:
　　 1.本研究中，首先合成了人硫氧還蛋白1的原核重組質(zhì)粒，通過PCR、雙酶切以及測序鑒定，均證

17、明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。接著將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21，進行人硫氧還蛋白的原核表達，對表達出的蛋白進行SDS-PAGE鑒定，其分子量大小與通過堿基數(shù)計算出來的大小一致，提示人硫氧還蛋白1的原核表達成功。
　　 2.用此蛋白免疫SD大鼠制備的抗血清，經(jīng)Elisa檢測，效價達到1:51200以上，進一步用Westernblot檢測，證明特異性良好，所制備的多克隆抗體能與人硫氧還蛋白1特異性結(jié)合。
　　 3.用此重組蛋白干預(yù)