整合多組學數(shù)據(jù)解析miRNA在大麥鹽脅迫響應和籽粒發(fā)育過程中的作用.pdf

1、microRNA(miRNA)是一類非編碼小RNA分子，其以堿基互補配對方式與基因mRNA結合，介導靶基因降解或抑制翻譯，進而參與基因表達調控，在植物生長、發(fā)育、逆境響應等過程中起著重要作用。大麥(Hordeum vulgare)是世界上第四大禾本科作物，同時也是最耐鹽的作物之一，廣泛種植于干旱、半干旱地區(qū)，應用于人類食物、動物飼料和啤酒釀造。隨著新一代高通量測序技術的發(fā)展和相關生物信息學分析手段的提高，整合多組學數(shù)據(jù)（如小RNA測序、

2、轉錄組、降解組等）為解析miRNA在大麥生長發(fā)育及逆境響應過程中的作用帶來了新的機遇。本研究采用多組學數(shù)據(jù)相結合的策略，一方面，比較分析大麥鹽脅迫響應及籽粒發(fā)育過程中的關鍵miRNAs及其調控靶基因，另一方面，系統(tǒng)分析野生大麥miRNAs，從miRNA角度比較分析野生大麥和栽培大麥間異同。本研究結果可豐富大麥miRNA數(shù)據(jù)，并揭示miRNA在大麥逆境響應、生長發(fā)育及進化過程中的作用。主要研究結果如下:
　　(1)大麥鹽脅迫相關mi

3、RNA的鑒定與功能分析
　　我們以大麥栽培品種Morex為研究材料，取鹽脅迫(100 mM)處理后3h、8h和27h及相應對照組樣品，分別構建6個小RNA文庫和1個降解組測序文庫，然后，利用IlluminaHiseq2000測序平臺進行高通量測序。數(shù)據(jù)分析共鑒定到152個miRNAs，包括28個大麥known miRNAs、114個同源miRNAs和10個novel miRNAs，隸屬于126個miRNAs家族。其中，44個miR

4、NAs在鹽脅迫條件下顯著差異表達，隸屬于39個miRNA家族，并且分別有14、4和11個miRNA家族為植物保守性、禾本科保守性和大麥鹽脅迫特異性表達。與對照組相比，絕大部分鹽脅迫響應相關miRNAs在鹽脅迫處理8h后表現(xiàn)為顯著上調表達，而在3h和27h時表現(xiàn)為下調表達。隨后，結合降解組測序和生物信息學，我們對所有鹽脅迫相關miRNAs靶基因進行系統(tǒng)分析，結果發(fā)現(xiàn)分別有86和37個參與新陳代謝和逆境響應相關基因受到大麥鹽脅迫響應相關mi

5、RNAs的調控，這些基因在鹽脅迫條件下主要表現(xiàn)為抑制植物生長和降低代謝活動。最后，我們利用qRT-PCR對部分miRNAs及其靶基因表達模式進行比較分析。綜上所述，至少有39個miRNA家族及其調控的123個靶基因參與大麥苗期早期鹽脅迫響應，這些結果可為進一步解析大麥耐鹽機制提供參考。
　　(2)利用高通量測序技術鑒定野生大麥miRNAs及其靶基因
　　野生大麥是栽培大麥的祖先種，其也是大麥遺傳改良的重要基因庫。在本研究中，

6、我們選用野生大麥Mt Gilboa barley3-25為材料，分別提取其不同發(fā)育階段根、莖、葉和穗等組織的總RNA，然后等量混合RNA并構建小RNA文庫。高通量測序共獲得9885815條clean reads，經(jīng)過數(shù)據(jù)分析，最終鑒定到55個known miRNAs、14個novelvariants和18個novel miRNAs。序列分析發(fā)現(xiàn)，本研究鑒定到的所有野生大麥miRNAs在4個大麥栽培品種中均具有高度保守性前體序列，尤其是在

7、成熟miRNA區(qū)間，表明miRNAs功能上的重要性決定其在大麥不同品系間高度保守。隨后，我們比較分析了14個novel variants和18個novel miRNAs在栽培大麥中的表達情況，結果發(fā)現(xiàn)21個miRNAs在栽培大麥morex中表達，包括7個novel variants和14個novel miRNAs，并且絕大部分表達miRNAs在栽培大麥和野生大麥間顯著差異表達(95.24％，20/21)，表明栽培大麥和野生大麥間表型變異

8、可能大部分來源于miRNAs的差異表達，而非基因組miRNAs組成。靶基因分析發(fā)現(xiàn)，有12個miRNA家族介導調控轉錄因子，包括8個植物保守性和4個wheat-barley保守性miRNA家族。此外，其它靶基因主要參與各種生理、代謝及逆境響應等過程。本研究首次在野生大麥中分析miRNAs，可為解析miRNAs在野生大麥中的調控作用提供參考。
　　(3)整合mRNA和小RNA表達分析解析大麥籽粒發(fā)育
　　大麥是研究禾本科作物籽

9、粒發(fā)育的重要模式材料，在本研究中，我們結合轉錄組和小RNA高通量測序，比較分析大麥籽粒發(fā)育過程中基因和小RNAs的動態(tài)表達變化，包括籽粒發(fā)育4個重要階段:早期物質存儲前期準備階段(stage01:0-5 DPA，開花后0-5天)，晚期物質存儲前期準備階段或過渡階段(stage02:6-10 DPA)、早期物質存儲階段(stage03:11-15 DPA)和levels off階段(stage04:16-20 DPA)。轉錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)

10、，在大麥籽粒發(fā)育過程中，初級和次級代謝相關基因表達活性均發(fā)生了顯著變化，并且轉錄活性變化與生理變化相一致，即隨著大麥籽粒的成熟，基因表達活性逐漸降低，變化最劇烈的時間出現(xiàn)在晚期物質存儲前期準備階段(stage02)向早期物質存儲階段(stage03)過渡時，并且ABA和糖信號轉導在階段轉換中起著重要作用。另外，籽粒自身光合作用相關基因表達最活躍時期出現(xiàn)在stage01和stage02，且主要參與脂肪代謝和核苷酸代謝，而非碳水化合物合成。

11、整合小RNAs數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，絕大部分miRNAs表達最活躍時期出現(xiàn)在基因表達最不活躍(stage04)和最活躍時期(stage01)，而siRNAs主要在基因最不活躍時期(stage03和stage04)表達活性最高，表明在大麥籽粒發(fā)育過程中，miRNAs可能主要扮演著“regulator”的角色，其通過介導基因表達調控參與各種新陳代謝過程，而siRNAs主要扮演著“silencer”的角色，主要負責抑制基因活性，直至種子休眠。此外，我