miRNA在脊髓發(fā)育及腫瘤分類中的作用.pdf

1、microRNA(miRNA)是一種大小約21～23個(gè)堿基的單鏈小分子RNA，是由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的約70-90個(gè)堿基大小的單鏈：RNA前體(pre-miRNA)經(jīng)過(guò)Dicer酶加工而成，在線蟲(chóng)、植物、昆蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物都有發(fā)現(xiàn)。近年來(lái)，隨著對(duì)miRNA在生物個(gè)體發(fā)育過(guò)程中的基因表達(dá)調(diào)控作用的認(rèn)識(shí)，使得miRNA的研究倍受關(guān)注，并成為當(dāng)前生命科學(xué)理論和應(yīng)用研究的熱點(diǎn)。在理論方面，重點(diǎn)研究miRNA如何通過(guò)參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)的調(diào)控，在細(xì)胞分化、增

2、殖和死亡、發(fā)育調(diào)控等方面發(fā)揮作用；在應(yīng)用方面，以miRNA為靶向的小分子RNA藥物正在成為生物藥物開(kāi)發(fā)新熱點(diǎn)，而組織特異性miRNA表達(dá)譜有可能成為腫瘤診斷、分級(jí)、分類與預(yù)后的新標(biāo)志。 一、miRNA在胚胎脊髓發(fā)育中作用機(jī)制的研究。 目的：篩選并鑒定胚胎脊髓組織中特異性miRNA，分析其在脊髓神經(jīng)細(xì)胞分化、增殖和發(fā)育過(guò)程中的基本功能，為深入研究胚胎神經(jīng)系統(tǒng)正常發(fā)育和畸形形成機(jī)制提供基礎(chǔ)。 方法：首先應(yīng)用寡核

3、苷酸芯片技術(shù)分析人12孕周和24孕周流產(chǎn)胎兒不同器官的全基因組miRNA表達(dá)譜，通過(guò)Northern Blot和聚類分析確定脊髓等中樞神經(jīng)系統(tǒng)特異性miRNA：通過(guò)全反式維甲酸(RA)誘導(dǎo)建立大鼠胚胎脊柱裂動(dòng)物模型，根據(jù)大鼠胚胎發(fā)育情況，分別在第13.5、15.5、17.5和19.5天取出胚胎，采用miRNA組織細(xì)胞原位雜交和Northern Blot等方法檢測(cè)脊髓發(fā)生過(guò)程中miRNA的表達(dá)情況，分析脊髓組織特異miRNA在神經(jīng)細(xì)胞分化

4、、增殖和發(fā)育中的作用。 結(jié)果：(1)分別構(gòu)建了12周和24周人胚心臟、肝、腎、肺、腦、脊髓等組織器官的全基因組miRNA表達(dá)譜，結(jié)果顯示158種人源mi=RNA的72％.83％在胚胎組織器官中表達(dá)，且相同發(fā)育階段的不同組織器官miRNA表達(dá)譜不同，而不同發(fā)育階段的相同組織器官，miRNA表達(dá)譜也不同；通過(guò)聚類分析，首次發(fā)現(xiàn)mir-9/9<'*>僅在人胎兒神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)，包括大腦和脊髓，以及miR-124a、miR-125b和m

5、iR-128等三種與mir-9/9<'*>協(xié)同表達(dá)的胚胎神經(jīng)系統(tǒng)特異miRNA。(2)在RA誘導(dǎo)的脊柱裂大鼠脊髓細(xì)胞凋亡明顯增加，表明RA處理可誘導(dǎo)胚胎發(fā)育晚期脊髓細(xì)胞的非正常死亡；Bcl-2與miR-9D*以及P53與miR-124a/125b具有相同的時(shí)空表達(dá)模式；且運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和背根神經(jīng)節(jié)中miR-124a/125b表達(dá)缺失。 結(jié)論：(1)本論文在大腦、脊髓等人胚胎神經(jīng)系統(tǒng)首次發(fā)現(xiàn)了獨(dú)特的miRNA表達(dá)譜，提示miRNA在

6、人胚胎大腦和脊髓發(fā)育過(guò)程中起重要作用。(2)本論文發(fā)現(xiàn)，RA誘導(dǎo)脊髓特異性miRNA表達(dá)下調(diào)主要為時(shí)空表達(dá)模式的失調(diào)，提示這些miRNA有可能通過(guò)RA誘導(dǎo)下調(diào)，進(jìn)而影響脊髓的正常發(fā)育或誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡；此外，本研究結(jié)果還顯示miR-9/9<'*>和miR-124a/125b可能通過(guò)調(diào)控Bcl-2和。P53通路，在感覺(jué)和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮作用。 二、miRNA用于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤分類研究。 目的：以神

7、經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤為對(duì)象，篩選并構(gòu)建腫瘤組織特異性miRNA表達(dá)譜，研究其作為腫瘤分級(jí)、分類及預(yù)后分子標(biāo)志的可行性。 方法：根據(jù)WHO臨床分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)收集新鮮的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤樣本，通過(guò)福爾馬林固定、石蠟包埋(FFPE)制作組織芯片(TMA)，采用miRNA芯片、組織細(xì)胞原位雜交(ISH)和Northern Blot等方法確定腫瘤組織miRNA表達(dá)特征，采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)腫瘤相關(guān)蛋白標(biāo)記，包括Ki-6

8、7、VEGF和GFAP等在腫瘤組織的定位與表達(dá)情況，通過(guò)聚類分析構(gòu)建腫瘤組織miRNA特異性表達(dá)譜。 結(jié)果：(1)對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤組織miRNA表達(dá)特征的研究結(jié)果顯示，人神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤中miR-9和miR-21表達(dá)的增加，而miR-124a、miR-125b表達(dá)的減少，結(jié)合病理診斷，發(fā)現(xiàn)組織特異性miRNA表達(dá)模式與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤的病理分級(jí)相關(guān)；此外，miRNA總體表達(dá)水平與Ki-67、VEGF以及GFAP標(biāo)志物之間呈負(fù)相關(guān)。

9、(2)對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤組織miRNA表達(dá)特征研究結(jié)果顯示，腫瘤組織基因組miRNA整體表達(dá)水平高于正常對(duì)照，有11種miRNA表達(dá)水平超過(guò)正常視網(wǎng)膜組織的2倍(N/T<0.5)，其中表達(dá)水平高于正常水平4倍的有miR.373<'*>、miR-503和miR-320；該結(jié)果與Northern Blot和組織細(xì)胞原位雜交結(jié)果一致。 結(jié)論：(1)根據(jù)本論文對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤組織miRNA表達(dá)特征的研究結(jié)果表明，miRNA是一類不同于現(xiàn)

10、有腫瘤標(biāo)志物的新型分級(jí)、分類標(biāo)志物，同時(shí)結(jié)合臨床病程、病理診斷以及聚類分析，提示神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤組織miRNA表達(dá)特征也可用于預(yù)后以及放、化療敏感性或耐藥性的判定，并特別提出miR-9、miR-21、miR-124a和miR-125b可能是神經(jīng)膠質(zhì)瘤診斷、治療和預(yù)后評(píng)估的關(guān)鍵標(biāo)志物。(2)在對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤組織miRNA表達(dá)特征的研究中，首次發(fā)現(xiàn)腫瘤基因組miRNA整體表達(dá)水平增高，提示視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的發(fā)病機(jī)制可能與其他實(shí)體瘤不同，其中m