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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:
我們實(shí)驗(yàn)室以前的研究表明小腦頂核可參與調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞功能。由于小腦與免疫系統(tǒng)之間沒(méi)有直接的結(jié)構(gòu)上的聯(lián)系,因此探討小腦調(diào)節(jié)免疫功能的途徑和機(jī)制對(duì)于更好地理解小腦的免疫調(diào)節(jié)功能具有重要的意義。下丘腦是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的免疫調(diào)節(jié)中樞。為此,本研究一方面進(jìn)一步揭示小腦頂核至下丘腦的神經(jīng)投射路徑及性質(zhì);另一方面,在上述研究的基礎(chǔ)上分別研究小腦頂核至下丘腦γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA)能和谷氨酸
2、能神經(jīng)投射對(duì)淋巴細(xì)胞功能的影響,以探討小腦頂核調(diào)節(jié)免疫功能的中樞和外周途徑,進(jìn)一步拓寬和加深對(duì)小腦神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)的認(rèn)識(shí)和理解。
方法:
1.單側(cè)小腦頂核內(nèi)微量注射葡聚糖-德克薩斯紅(Texas red dextran amine, TRDA),順行追蹤頂核至下丘腦的神經(jīng)投射路徑及終止部位。單側(cè)下丘腦外側(cè)區(qū)(lateral hypothalamic area, LHA)內(nèi)微量注射逆行追蹤劑紅色熒光金(Fluoro-Rub
3、y, FR),結(jié)合GABA和谷氨酸免疫熒光組織化學(xué)染色,進(jìn)一步確定頂核至下丘腦投射的性質(zhì)。
2.雙側(cè)小腦頂核內(nèi)微量注射GABA降解酶—GABA轉(zhuǎn)氨酶的抑制劑氨已烯酸(vigabatrin,VGB)或GABA合成酶—谷氨酸脫羧酶的抑制劑3-巰基丙酸(3-mercaptopropionic acid,3-MP),并以未作任何處理的空白大鼠和雙側(cè)小腦頂核注射等量生理鹽水的大鼠作為對(duì)照。注射后第3天,用羧基熒光素琥珀酰亞胺酯(carb
4、oxyl fluorescein succinimidyl ester, CFSE)和抗CD3抗體流式雙標(biāo)技術(shù)檢測(cè)T淋巴細(xì)胞對(duì)刀豆蛋白A(concanavalin A, Con A)刺激的增殖反應(yīng);用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)檢測(cè)血清中抗綿羊紅細(xì)胞(sheep red blood cells, SRBC)特異性 IgM抗體水平;動(dòng)物于第6天加強(qiáng)注射藥物,3天后用CA
5、M/EH-1流式雙標(biāo)技術(shù)檢測(cè)脾臟自然殺傷(natural killer, NK)細(xì)胞殺傷腫瘤靶細(xì)胞YAC-1的活性。在檢測(cè)淋巴細(xì)胞功能的同時(shí),用FR逆行追蹤結(jié)合GABA免疫組化染色檢測(cè)頂核至LHA投射中GABA能神經(jīng)元數(shù)目的變化,并用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography, HPLC)檢測(cè)下丘腦中GABA的含量變化。
3.大鼠用小牛血清白蛋白(bovine serum al
6、bumin, BSA)進(jìn)行免疫。免疫后第3天,雙側(cè)小腦頂核內(nèi)微量注射谷氨酸合成酶—谷氨酰胺酶的抑制劑6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸(6-diazo-5-oxo-L-norleucine, DON),同時(shí)雙側(cè) LHA或丘腦腹外側(cè)核(ventrolateral thalamic nuclei, VL)內(nèi)微量注射谷氨酸膜轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑蘇式-3-羥基天冬氨酸(D,L-threo-β-hydroxyaspartic acid, THA)。動(dòng)物飼養(yǎng)
7、3天,用抗CD3,CD4, CD8,CD45RA和NKR-P1A抗體標(biāo)記流式檢測(cè)外周血中T細(xì)胞及其亞群,B細(xì)胞和NK細(xì)胞的百分比變化;用CD3/CD25和CD3/CFSE流式雙標(biāo)技術(shù)分別檢測(cè)腸系膜淋巴結(jié)T細(xì)胞對(duì)Con A刺激的活化和增殖能力;用real-time PCR法檢測(cè)淋巴結(jié)T細(xì)胞中細(xì)胞因子IL-2,IFN-γ,IL-4,IL-5,IL-10,TGF-β,IL-22,IL-17 mRNA的表達(dá)及用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞
8、因子IL-2,IFN-γ,IL-4,IL-10,TGF-β,IL-22, IL-17的水平。此外,大鼠B細(xì)胞抗BSA IgM和IgG抗體生成能力及脾臟NK細(xì)胞的殺傷活性也分別用 ELISA法及流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。在檢測(cè)上述淋巴細(xì)胞功能的同時(shí),同樣用FR逆行追蹤結(jié)合谷氨酸免疫組化染色檢測(cè)頂核至LHA投射中谷氨酸能神經(jīng)元數(shù)目的變化,以及用HPLC法檢測(cè)下丘腦及丘腦組織中谷氨酸含量的變化。
4.注射DON及THA后第3天,用ELIS
9、A法檢測(cè)血清中促腎上腺皮質(zhì)激素(adrenocorticotropic hormone,ACTH),皮質(zhì)醇(cortisol),促甲狀腺激素(thyroid stimulating hormone,TSH),三碘甲狀腺原氨酸(triiodothyronine,T3)及甲狀腺素(thyroxin,T4)的水平,用HPLC法進(jìn)行檢測(cè)外周免疫器官脾臟及淋巴結(jié)中去甲腎上腺素(norepinephrine,NE)的含量變化。
結(jié)果:
10、r> 1.頂核神經(jīng)元發(fā)出的TRDA陽(yáng)性纖維,在小腦上腳中走行,至小腦上腳交叉處交叉至對(duì)側(cè),并進(jìn)入下丘腦,主要終止于LHA。在LHA注射逆行追蹤劑FR,標(biāo)記的陽(yáng)性纖維逆行穿行于小腦上腳交叉,并可到達(dá)小腦頂核。結(jié)合免疫熒光組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)頂核投射到LHA的神經(jīng)元既有GABA能又有谷氨酸能。
2.雙側(cè)頂核注射VGB導(dǎo)致腸系膜淋巴結(jié)T細(xì)胞對(duì)Con A誘導(dǎo)的增殖反應(yīng),血清中抗SRBC IgM抗體水平及脾臟NK細(xì)胞殺傷腫瘤YAC-1靶細(xì)
11、胞的殺傷活性均低于空白組及頂核注射生理鹽水的對(duì)照組。而雙側(cè)頂核注射3-MP,可導(dǎo)致相反的變化。與此同時(shí),頂核注射VGB可顯著增加頂核至LHA投射中GABA能神經(jīng)元的數(shù)目和下丘腦中GABA的含量,而頂核注射3-MP,頂核至LHA投射中GABA能神經(jīng)元的數(shù)目和下丘腦中GABA的含量均降低。
3.雙側(cè)頂核注射DON后,外周血中CD3+T細(xì)胞,CD3+CD4+T細(xì)胞數(shù)目及CD4/CD8比值均低于空白組和頂核注射生理鹽水的對(duì)照組,而CD
12、3+CD8+T細(xì)胞數(shù)目沒(méi)有顯著變化;腸系膜淋巴結(jié)T細(xì)胞的活化和增殖能力降低;淋巴結(jié)T細(xì)胞致炎細(xì)胞因子IL-2,IFN-γ,IL-17,IL-22的mRNA表達(dá)及在細(xì)胞培養(yǎng)上清中的含量均顯著低于空白組和生理鹽水對(duì)照組,而抗炎細(xì)胞因子IL-4,IL-10,IL-5,TGF-β的mRNA表達(dá)和培養(yǎng)上清中IL-4,IL-10,TGF-β的含量沒(méi)有顯著變化。另外,外周血中B細(xì)胞數(shù)目及血清中抗BSA IgM和IgG水平也明顯下降。外周血中NK細(xì)胞數(shù)
13、目及脾臟NK細(xì)胞殺傷活性也明顯降低。與此同時(shí),頂核注射DON后,頂核至LHA投射中谷氨酸能神經(jīng)元的數(shù)量及下丘腦中谷氨酸的含量也降低。頂核注射DON聯(lián)合LHA注射THA可使上述外周血中CD3+及CD3+CD4+T細(xì)胞數(shù)目和CD4/CD8比值,淋巴結(jié)T細(xì)胞的活化和增殖,致炎細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)和細(xì)胞培養(yǎng)上清中的含量都顯著高于單獨(dú)頂核注射DON組。此外,外周血中B細(xì)胞數(shù)目及血清中抗BSA抗體水平,外周血中NK細(xì)胞數(shù)目及脾臟NK細(xì)胞殺傷活性也
14、均高于單純頂核注射DON組。同時(shí)下丘腦中谷氨酸的含量也比單純頂核注射DON組有所升高。頂核至VL也有直接的谷氨酸能神經(jīng)投射,而頂核注射DON的同時(shí)VL注射THA,雖然丘腦中谷氨酸的含量較單純頂核注射DON有所升高,但上述T,B,NK細(xì)胞的數(shù)目和功能降低沒(méi)有顯著改變。
4.雙側(cè)頂核注射DON可導(dǎo)致脾臟和淋巴結(jié)中NE含量高于空白組和生理鹽水對(duì)照組,聯(lián)合LHA注射THA后脾臟和淋巴結(jié)中NE含量較單純注射DON組有所降低。動(dòng)物注射DO
15、N及THA,血清中ACTH,皮質(zhì)醇,TSH,T3及T4的水平?jīng)]有顯著變化。
結(jié)論:
1.小腦頂核發(fā)出直接的神經(jīng)纖維投射至下丘腦,主要終止于LHA;這些神經(jīng)投射中有GABA能和谷氨酸能纖維。
2.小腦頂核的GABA能神經(jīng)元調(diào)節(jié)T、B和NK細(xì)胞的功能,此調(diào)節(jié)作用由頂核至下丘腦的GABA能神經(jīng)投射所介導(dǎo)。
3.小腦頂核的谷氨酸能神經(jīng)元調(diào)節(jié)T、B和NK細(xì)胞的數(shù)目和功能,這種調(diào)節(jié)作用由頂核投射至下丘腦而不是
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