兩型囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運體VGLUT在口面部感覺傳導(dǎo)路中的表達(dá)和功能研究.pdf

1、谷氨酸(Glutamate)作為神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)部分布最為廣泛的一種興奮性神經(jīng)遞質(zhì),廣泛參與各種神經(jīng)功能的調(diào)控。生物體通過復(fù)雜的神經(jīng)傳導(dǎo)通路實現(xiàn)對外周感覺信息的接收、傳遞和整合,從而對環(huán)境進行感知,進而產(chǎn)生合理的反應(yīng),以維系生物體的正常生理活動。大量的研究已經(jīng)證實,谷氨酸作為經(jīng)典的興奮性神經(jīng)遞質(zhì),同樣承載感覺信息的傳遞。軀體感覺信息傳導(dǎo)系統(tǒng)主要包括脊髓傳導(dǎo)路和三叉?zhèn)鲗?dǎo)路,兩者分別負(fù)責(zé)軀干感覺信息和口面部感覺信息向高級腦中樞的傳遞,已有的研究表

2、明,這兩條感覺傳導(dǎo)路均由谷氨酸能神經(jīng)元組成。其中,三叉?zhèn)鲗?dǎo)路首先由位于三叉神經(jīng)節(jié)(TG)及三叉神經(jīng)中腦核(Vme)內(nèi)的假單極神經(jīng)元的外周突來感知口面部各種感覺信息的刺激,其中樞突將信息傳遞至三叉神經(jīng)感覺復(fù)合體(TSNC,由尾側(cè)向吻側(cè)依次是三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)亞核Vc、極間亞核Vi、吻側(cè)亞核Vo以及感覺主核Vp),再向上投射至感覺丘腦(主要包括丘腦腹后內(nèi)側(cè)核VPM和丘腦后核Po),經(jīng)過整合最終傳遞至大腦感覺皮質(zhì)。運用免疫組織化學(xué)及藥理電生理

3、的方法,研究人員已證實三叉?zhèn)鲗?dǎo)路各級結(jié)構(gòu)主要由谷氨酸能神經(jīng)元組成,因此,谷氨酸在三叉系統(tǒng)各級神經(jīng)元突觸傳遞間的釋放活動,對于口面部感覺信息的正常傳遞具有重要意義,也可能是介導(dǎo)三叉神經(jīng)痛在內(nèi)的各種口面部異常感覺疾病的潛在發(fā)病因素。
　　經(jīng)典的模型認(rèn)為,神經(jīng)遞質(zhì)主要是通過突觸小泡釋放入突觸間隙的,而組成負(fù)責(zé)谷氨酸釋放的突觸小泡的膜蛋白,直到上世紀(jì)末才被成功克隆,他們也因此被命名為囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運體(VGLUT)。到目前為止,先后有三種

4、亞型的VGLUT被克隆,分別是VGLUT1、VGLUT2和VGLUT3。其中VGLUT1和VGLUT2特異性地表達(dá)于谷氨酸能神經(jīng)元內(nèi),因此目前被廣泛應(yīng)用為谷氨酸能神經(jīng)元的標(biāo)記蛋白。隨著對這兩種蛋白研究的不斷深入,研究人員發(fā)現(xiàn)了一種極為有趣的現(xiàn)象,即VGLUT1和VGLUT2在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)呈互補分布模式,前者主要表達(dá)于皮層和前腦,而后者則主要表達(dá)于丘腦和腦干,且在整個神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi),單個神經(jīng)元內(nèi)VGLUT1與VGLUT2的共表達(dá)也是極為少見的。

5、這就引發(fā)了一個疑問,為什么同樣的功能要招募不同的兩個蛋白來完成,且二者在定位上互相排斥,最有可能的解釋就是,雖然兩型VGLUT同樣都能介導(dǎo)谷氨酸的囊泡釋放,但二者仍很可能存在某種功能學(xué)上的差異。
　　事實上,已經(jīng)有一些研究表明,VGLUT1與顯示活動依賴性的突觸可塑性(如LTP,long term potentiation)的突觸結(jié)構(gòu)密切相關(guān),而表達(dá)VGLUT2的突觸結(jié)構(gòu)則具備信息傳遞的高保真度。另外,利用基因敲除動物的研究也發(fā)現(xiàn)

6、,敲除VGLUT1的動物與敲除VGLUT2的動物的行為障礙表現(xiàn)是不同的。越來越多的形態(tài)學(xué)研究也不斷證明,兩種 VGLUT在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)呈高度的互補分布。一系列的研究均表明, VGLUT1與VGLUT2,雖然在氨基酸構(gòu)成上有高達(dá)82％的相似度,雖然同樣構(gòu)成介導(dǎo)谷氨酸突觸釋放的囊泡蛋白,但二者一定存在某種功能上的差異。
　　前文已經(jīng)提到,口面部感覺信息的傳遞是由三叉神經(jīng)傳導(dǎo)路上的各級谷氨酸能神經(jīng)元實現(xiàn)的,那么,特異性表達(dá)于谷氨酸能神經(jīng)元

7、內(nèi)的兩種不同類型的囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運體,即VGLUT1與VGLUT2在三叉系統(tǒng)內(nèi)的表達(dá)是否同樣符合互補分布的特點,如果是這樣,二者是否存在功能學(xué)上的差異,從而使得整個三叉神經(jīng)傳導(dǎo)系統(tǒng)通過招募不同亞型的VGLUT來對不同類型的口面部感覺信息進行傳遞和整合。揭開這些疑問,將更有利于我們闡明興奮性三叉神經(jīng)傳導(dǎo)系統(tǒng)的正常生理功能,還可能揭開某些口面部感覺障礙,尤其是口面部異常疼痛(如三叉神經(jīng)痛)的可能發(fā)病機制。實驗內(nèi)容如下:
　　第一部分口

8、面部初級感覺信息傳遞通路內(nèi)兩型VGLUT的表達(dá)
　　目的:分析三叉神經(jīng)初期感覺纖維終末內(nèi) VGLUT的表達(dá)類型和來源,初步闡釋口面部初級感覺信息傳遞過程中兩種 VGLUT發(fā)揮的可能作用。方法:利用免疫熒光雙重標(biāo)記技術(shù)觀察TSNC各亞核內(nèi)VGLUT1與VGLUT2陽性終末的分布以及兩種 VGLUT在單個終末內(nèi)的共存;切斷三叉神經(jīng)感覺根后觀察 TSNC各亞核內(nèi)VGLUT1與VGLUT2免疫陽性終末密度的變化;利用跨三叉神經(jīng)節(jié)束路追蹤結(jié)

9、合雙重免疫熒光標(biāo)記技術(shù)觀察 TSNC內(nèi)外周來源的初級感覺信息傳遞纖維內(nèi) VGLUT的表達(dá)類型。結(jié)果:除Vc淺層集中分布VGLUT2以外,TSNC各亞核內(nèi)VGLUT1與VGLUT2陽性終末均勻分布,但不存在兩種 VGLUT在單個終末內(nèi)的共存;切斷三叉神經(jīng)感覺根后,同側(cè)Vp、Vo、Vi以及Vc內(nèi)VGLUT1陽性纖維密度顯著下降,而VGLUT2陽性纖維密度則無明顯變化,僅Vc淺層內(nèi)VGLUT2陽性纖維密度下降;外周注射標(biāo)記有髓纖維的跨節(jié)示蹤劑

10、CTB后,Vp、Vo、Vi以及Vc深層內(nèi)分布有豐富的CTB陽性纖維終末,標(biāo)記終末內(nèi)表達(dá)VGLUT1而不表達(dá)VGLUT2;外周注射標(biāo)記無髓纖維的跨節(jié)示蹤劑WGA-HRP后,僅Vc淺層內(nèi)分布有WGA-HRP陽性纖維終末,且陽性終末內(nèi)表達(dá)VGLUT2而不表達(dá)VGLUT1。結(jié)論:口面部外周初級感覺信息傳遞纖維主要表達(dá)VGLUT1,這也是TSNC內(nèi)VGLUT1陽性終末的主要來源, TSNC內(nèi)VGLUT2陽性終末則主要來源于中樞,但Vc淺層內(nèi)部分來

11、源于外周的無髓神經(jīng)纖維內(nèi)也表達(dá) VGLUT2,提示口面部外周初級感覺信息的一般信息和傷害性信息分別與VGLUT1和VGLUT2的功能相關(guān)。
　　第二部分TSNC傳出投射-口面部二級感覺信息傳導(dǎo)通路-內(nèi)兩型VGLUT的表達(dá)
　　目的:檢測 TSNC各亞核向不同上位中繼腦結(jié)構(gòu)發(fā)出的傳出投射的纖維終末內(nèi)VGLUT的表達(dá)類型,初步闡釋口面部二級感覺信息傳導(dǎo)路中VGLUT1與VGLUT2的參與作用。方法:采用雙重?zé)晒庠环肿与s交(du

12、al FISH)方法檢測VGLUT1 mRNA與VGLUT2 mRNA在TSNC各亞核內(nèi)的表達(dá)與共存,采用順行束路追蹤結(jié)合多重免疫熒光標(biāo)記以及雙重免疫電鏡檢測 TSNC各亞核傳出投射終末內(nèi) VGLUT的表達(dá)類型;采用逆行束路追蹤結(jié)合 FISH檢測 TSNC內(nèi)丘腦及小腦投射神經(jīng)元內(nèi) VGLUT mRNA的表達(dá)類型。結(jié)果:Vo、Vi以及Vc內(nèi)VGLUT1 mRNA與VGLUT2 mRNA雜交信號鮮有共存,Vp內(nèi)存在大量中小直徑神經(jīng)元同時表達(dá)

13、 VGLUT1 mRNA與VGLUT2 mRNA;Vo、Vi以及Vc投射到丘腦的纖維終末僅表達(dá)VGLUT2,而向小腦投射的纖維終末僅表達(dá)VGLUT1,Vp向VPM投射的纖維終末同時表達(dá)VGLUT1與VGLUT2,逆行束路追蹤結(jié)合FISH檢測結(jié)果與此相符合。結(jié)論:TSNC內(nèi)向感覺丘腦投射的神經(jīng)元主要是VGLUT2 mRNA陽性的,而向小腦投射的神經(jīng)元主要是VGLUT1 mRNA陽性的,Vp內(nèi)向VPM投射的神經(jīng)元同時表達(dá)VGLUT1 mRN

14、A與VGLUT2 mRNA。
　　第三部分下調(diào)延髓背角內(nèi)VGLUT2對口面部痛信息傳遞的影響
　　目的:觀察靶向下調(diào)大鼠延髓背角內(nèi)VGLUT2的表達(dá)對其痛行為的影響。方法:利用攜帶報告基因的VGLUT2表達(dá)質(zhì)粒以及表達(dá)針對VGLUT2 shRNA的表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,對預(yù)先設(shè)計的VGLUT2 shRNA片段進行體外篩選;包裝能夠表達(dá)所篩選VGLUT2 shRNA片段的慢病毒載體,感染大鼠原代培養(yǎng)神經(jīng)元,驗證對VG

15、LUT2的表達(dá)下調(diào)作用;將該慢病毒載體注射入大鼠延髓背角,觀察對大鼠口面部痛行為的影響。結(jié)果:利用luciferase熒光酶報告值在體外成功篩選出能夠有效下調(diào) VGLUT2表達(dá)的shRNA片段,表達(dá)該片段的慢病毒可以高效感染大鼠原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元并有效下調(diào)其內(nèi)VGLUT2的表達(dá),將該慢病毒載體注射入大鼠延髓背角在有效下調(diào)其內(nèi)VGLUT2的同時,還能削弱痛模型動物的痛敏行為。結(jié)論:靶向下調(diào)大鼠延髓背角內(nèi)VGLUT2的表達(dá)可以有效干預(yù)動物的