2型囊泡谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體與神經(jīng)病理性疼痛的相關(guān)性研究.pdf

1、研究背景：
　　谷氨酸在疼痛信號(hào)的傳遞和調(diào)控過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。已有大量研究證實(shí)，神經(jīng)病理性疼痛與谷氨酸過度釋放有關(guān)。囊泡谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(vesicular glutamatetransporters，VGLUTs)，負(fù)責(zé)將胞內(nèi)的谷氨酸攝取入囊泡，完成谷氨酸的儲(chǔ)存、隔離和釋放，因此對(duì)突觸間隙的谷氨酸動(dòng)態(tài)平衡具有重要影響。在VGLUTs的3個(gè)亞型中，2型囊泡谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(vesicular glutamate transporter2

2、，VGLUT2)主要表達(dá)于脊髓、丘腦和低位腦干，在一些杏仁核和皮層結(jié)構(gòu)中也有表達(dá)，提示VGLUT2可能參與了疼痛信號(hào)的傳遞和加工。近期的研究發(fā)現(xiàn)VGLUT2表達(dá)降低的小鼠神經(jīng)病理性疼痛表現(xiàn)消失或減弱，同時(shí)VGLUT2表達(dá)降低導(dǎo)致丘腦神經(jīng)元興奮性突觸后電流幅度和頻率下降，進(jìn)一步表明VGLUT2與神經(jīng)病理性疼痛相關(guān)。盡管如此，神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生發(fā)展過程中VGLUT2的表達(dá)是否發(fā)生改變，VGLUT2的表達(dá)變化如何影響谷氨酸能神經(jīng)傳遞，抑制VG

3、LUT2的功能能否對(duì)抗疼痛等等還鮮有報(bào)道。本研究室前期研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)病理痛大鼠的背根神經(jīng)節(jié)、脊髓中VGLUT2的表達(dá)上調(diào)，本研究重點(diǎn)關(guān)注神經(jīng)病理痛進(jìn)程中小鼠腦內(nèi)VGLUT2的表達(dá)和功能變化，以及VGLUT抑制劑對(duì)谷氨酸釋放和疼痛行為的影響。
　　研究目的：
　　研究神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生發(fā)展過程中小鼠腦內(nèi)VGLUT2表達(dá)與功能的改變及其影響疼痛信息傳遞的機(jī)制，觀察VGLUT抑制劑功能對(duì)動(dòng)物疼痛反應(yīng)和谷氨酸釋放的影響。
　　

4、研究方法：
　　第一部分是建立神經(jīng)病理性疼痛模型，觀察不同時(shí)間點(diǎn)疼痛相關(guān)腦區(qū)VGLUT2表達(dá)的改變，探討VGLUT2表達(dá)改變對(duì)谷氨酸囊泡攝取和釋放的影響。包括:1）建立坐骨神經(jīng)選擇性損傷(spared nerve injury，SNI)模型:結(jié)扎并剪斷C57小鼠坐骨神經(jīng)三個(gè)分支中的腓總神經(jīng)和脛神經(jīng)，保持腓腸神經(jīng)不受損傷。術(shù)后以VonFrey法測試動(dòng)物腓腸神經(jīng)支配域機(jī)械痛閾的變化。2）VGLUT2表達(dá)檢測:于SNI造模后不同時(shí)間（0

5、.5，1，1.5，3，7，14，28天）取小鼠全腦，采用免疫組織化學(xué)法檢測丘腦、水管周圍灰質(zhì)(Periaqueductal gray，PAG)、雙側(cè)杏仁核和雙側(cè)內(nèi)側(cè)前額葉皮層(medial prefrontal cortex，mPFC)中VGLUT2表達(dá)的改變。3）VGLUT2功能檢測:在囊泡谷氨酸攝取實(shí)驗(yàn)中，分別于SNI造模后1天和14天，分離丘腦突觸囊泡并與系列濃度的谷氨酸共同孵育，應(yīng)用微透析和HPLC-ECD測定孵育液中谷氨酸濃度

6、的變化，以此反映谷氨酸的囊泡攝取;在突觸體谷氨酸釋放實(shí)驗(yàn)中，分別于SNI造模后1天和14天，制備丘腦突觸體，與谷氨酸脫氫酶及NADP+共孵育，通過熒光酶標(biāo)儀檢測反應(yīng)產(chǎn)物NADPH的熒光強(qiáng)度，以確定孵育液中谷氨酸濃度。
　　第二部分是選擇系列VGLUT功能抑制劑作為工具藥，研究抑制劑對(duì)神經(jīng)痛小鼠機(jī)械痛閾和丘腦谷氨酸釋放的影響，以及對(duì)疼痛相關(guān)腦區(qū)神經(jīng)元c-Fos表達(dá)的影響;觀察抑制劑對(duì)動(dòng)物運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力與其他疼痛行為的影響。包括1）抑制

7、VGLUT功能對(duì)疼痛的影響:在SNI和奧沙利鉑誘發(fā)神經(jīng)痛的形成期或維持期，腦室給藥VGLUT抑制劑，觀察動(dòng)物機(jī)械痛閾的變化。2）對(duì)運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性和其他疼痛的作用:采用轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)研究VGLUT抑制劑腦室給藥對(duì)動(dòng)物運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性的影響，并在小鼠熱板模型、福爾馬林模型及醋酸扭體模型上對(duì)抑制劑進(jìn)行作用研究。3)對(duì)c-Fos表達(dá)的影響:免疫組化法檢測抑制劑對(duì)SNI術(shù)后早期腦內(nèi)c-Fos表達(dá)的影響。4）突觸體谷氨酸釋放的測定:SNI造模后1天提取動(dòng)物的丘腦突

8、觸體，與VGLUT抑制劑共孵育，熒光酶標(biāo)儀檢測抑制劑對(duì)動(dòng)物去極化引發(fā)的谷氨酸釋放的影響。
　　研究結(jié)果：
　　1)SNI術(shù)后VGLUT2表達(dá)和功能的改變
　　SNI造模后1天，丘腦、PAG和雙側(cè)杏仁核中VGLUT2表達(dá)均顯著升高，從造模后1.5天開始到28天VGLUT2表達(dá)逐漸下降到假手術(shù)水平;SNI術(shù)后1天，小鼠丘腦突觸體囊泡的谷氨酸攝取速率，在外加谷氨酸濃度為1000μM和2000μM時(shí)顯著升高，而SNI術(shù)后14天

9、的谷氨酸攝取速率沒有明顯變化;SNI術(shù)后1天，小鼠丘腦突觸體去極化引發(fā)的谷氨酸釋放明顯升高，在術(shù)后14天，谷氨酸的釋放與假手術(shù)組相比沒有明顯差別。
　　2)VGLUT抑制劑對(duì)神經(jīng)痛疼痛反應(yīng)的影響
　　SNI損傷后立即腦室注射VGLUT抑制劑CSB6B（5μg/只）、Rose Bengal(5μg/只)、Xanthurenic Acid（10μg/只）、Brilliant Yellow（5μg/只）之后每12小時(shí)注射一次，與溶

10、劑組(aCSF，5μl/只)相比，能顯著抑制SNI術(shù)后0.5天和1天的動(dòng)物機(jī)械痛閾下降，而在SNI術(shù)后的疼痛維持期，CSB6B和Rose Bengal(5μg，i.c.v.)沒有明顯的鎮(zhèn)痛作用;在奧沙利鉑致神經(jīng)痛模型上，造模同時(shí)每12小時(shí)CSB6B（5μg，i.c.v.）伴隨給藥，與模型組相比，能夠明顯抑制奧沙利鉑第一次給藥后1.5到4天的動(dòng)物機(jī)械痛閾下降。CSB6B（1 mg·kg-1，i.p.）預(yù)防或治療性給藥對(duì)SNI誘發(fā)的機(jī)械痛敏

11、均無顯著的鎮(zhèn)痛作用。
　　3)VGLUT抑制劑對(duì)對(duì)運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性和其他疼痛的影響
　　動(dòng)物運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)功能的研究表明，CSB6B（5μg，i.c.v.）對(duì)小鼠的轉(zhuǎn)棒掉落潛伏期沒有明顯影響。CSB6B(2.5 mg·kg-1，i.p.)對(duì)小鼠50和55℃的熱板反應(yīng)沒有明顯的影響;CSB6B（2.5 mg·kg-1，i.p.）作用30 min和60 min能夠明顯抑制醋酸引發(fā)的小鼠扭體反應(yīng);CSB6B（0.5 mg·kg-1，i.p.）

12、作用30 min后能夠明顯降低小鼠福爾馬林模型的二相舔足時(shí)間，而對(duì)福爾馬林一相疼痛沒有明顯影響。
　　4)VGLUT抑制劑對(duì)神經(jīng)痛c-Fos表達(dá)和谷氨酸釋放的影響
　　c-Fos表達(dá)的檢測結(jié)果表明，丘腦、PAG在SNI術(shù)后1天，PAG和對(duì)側(cè)mPFC在SNI術(shù)后1.5天時(shí)，與假手術(shù)組相比，模型組神經(jīng)元c-Fos的表達(dá)明顯上升;與模型組相比，CSB6B(5μg，i.c.v.)能夠明顯降低丘腦在SNI術(shù)后0.5天與對(duì)側(cè)mPFC在術(shù)

13、后1.5天的c-Fos表達(dá)。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，CSB6B與SNI術(shù)后丘腦突觸體共孵育30 min后能夠明顯抑制突觸的谷氨酸釋放，IC50為25.7μM。
　　結(jié)論：
　　神經(jīng)病理性疼痛早期腦內(nèi)VGLUT2表達(dá)升高，同時(shí)丘腦神經(jīng)元囊泡谷氨酸攝取和突觸體谷氨酸釋放能力均顯著增強(qiáng)，提示VGLUT2在神經(jīng)痛早期發(fā)揮了作用。VGLUT功能抑制劑不影響動(dòng)物運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力，卻可緩解動(dòng)物神經(jīng)痛早期的機(jī)械痛敏，抑制神經(jīng)痛誘導(dǎo)的c-Fos表達(dá)。VG