藥物活性評價、代謝分析和晶型技術(shù)在藥物發(fā)現(xiàn)中的應(yīng)用研究.pdf

1、藥物發(fā)現(xiàn)是藥物研究最初始的步驟,也是一個復(fù)雜的研究和探索過程?，F(xiàn)代主動藥物發(fā)現(xiàn)的藥物篩選過程主要包括靶點的識別和確證、先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)和優(yōu)化、成藥性評價等過程。因此,藥物發(fā)現(xiàn)是集成多種技術(shù)方法進行系統(tǒng)研究的過程。
　　 在藥物發(fā)現(xiàn)階段,最重要的研究內(nèi)容是藥物的藥理作用,只有具備了一定的藥理作用,才有可能成為藥物；但是,由于影響藥物的因素是多方面的,僅僅具備了藥理作用的物質(zhì)并不一定能夠成為藥物,化合物的作用機制、ADME/T特征以

2、及物質(zhì)的狀態(tài),都影響到一種物質(zhì)的成藥性。
　　 本文采用活性評價技術(shù)、藥物作用機制研究技術(shù)、藥物ADME/T特點研究技術(shù)和藥物的晶型研究技術(shù),對匹諾塞林和尼群地平進行了成藥性評價,探討不同技術(shù)在新藥發(fā)現(xiàn)中的應(yīng)用。
　　 第一章匹諾塞林抗大鼠腦缺血再灌注損傷作用的研究
　　 本章在前期初步證明PNCB具有神經(jīng)保護和血管內(nèi)皮功能保護等多種作用的基礎(chǔ)上,對該化合物抗全腦缺血再灌注的作用進行了評價。已有實驗證明,PNCB

3、在體外的活性作用有一定的濃度范圍,PNCB的濃度過高,其作用反而有下降的趨勢,推測這一現(xiàn)象與PNCB在不同的濃度范圍內(nèi),作用的靶點和激活的信號傳導(dǎo)通路不同有關(guān)。本研究利用大鼠全腦缺血模型(4VO),以神經(jīng)保護通路為中心,通過研究不同劑量PNCB對抗大鼠腦缺血再灌注損傷的機制,探討PNCB抗大鼠腦缺血再灌注損傷的最佳劑量。
　　 結(jié)果發(fā)現(xiàn):(1)大鼠全腦缺血再灌注30min后給予5mg/kg PNCB的保護作用最強,給予10mg/

4、kg PNCB的保護作用反而下降。再灌注前給藥的作用不明顯。(2)PNCB的神經(jīng)保護作用,涉及與CREB相關(guān)的一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,以及TORC-1、CAMKⅡ、PI3K、Akt、p38MAPK、JNK等信使。這些信使的活化可能與突觸型NMDA受體開放有關(guān),不同的信使作用于腦缺血損傷及PNCB給藥后的不同階段,對不同劑量PNCB的反應(yīng)性不同。(3)PNCB的神經(jīng)保護作用,可能足通過抑制非突觸型NMDA受體發(fā)揮的。(4)PNCB濃度過高時,

5、神經(jīng)保護的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路不同程度地被關(guān)閉,從而保護作用下降。因此,5mg/kg是PNCB抗腦缺血再灌注損傷的最佳劑量。
　　 本章研究表明,在活性評價過程中結(jié)合作用機制對化合物的活性作用進行綜合探討,有助于尋找化合物的作用靶點,分析相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。同時,在對化合物的活性作用進行研究時,也需要注意化合物在不同劑量范圍內(nèi)的表現(xiàn)。這將為下一步研究中候選化合物藥效學(xué)、藥代動力學(xué)、毒理學(xué)等實驗的劑量設(shè)置提供有力的參考。
　　 第

6、二章基于海兔模型的匹諾塞林對神經(jīng)功能作用的研究
　　 本章建立了用美國加州海兔評價藥物活性的模型,考察了PNCB對海兔神經(jīng)功能的作用。
　　 本研究利用海兔感覺神經(jīng)元/運動神經(jīng)元體外共培養(yǎng)模型,觀察PNCB的電生理作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn):(1)PNCB對SN/L7的興奮性突觸傳遞具有可逆的抑制作用,這一作用與PNCB的濃度有關(guān),PNCB濃度低于100μM時,作用強度與PNCB濃度負相關(guān),PNCB濃度高于100μM時,作用強度與P

7、NCB濃度正相關(guān)。(2)20μM PNCB可逆地使SN/L7對5-HT的反應(yīng)性消失。(3)10μM PNCB對SN/L7的長時程突觸可塑性的影響不明顯。以上結(jié)果提示:PNCB可能作用于SN/L7突觸部位的離子通道。
　　 神經(jīng)突觸的易化涉及新蛋白的合成,早期表現(xiàn)為rRNA轉(zhuǎn)錄水平的升高。本研究通過標記海兔核仁蛋白FBL,考察海兔感覺神經(jīng)元核仁形態(tài)與突觸成熟以及可塑性過程的聯(lián)系,建立了利用核仁DFC區(qū)熒光標記判斷細胞rRNA轉(zhuǎn)錄活

8、性的方法。根據(jù)5-HT易化神經(jīng)突觸,PKC抑制劑chelyrethrine、PARP-1抑制劑PJ34抑制神經(jīng)突觸的作用,進一步確證了核仁形態(tài)與細胞活性的聯(lián)系?；谝陨涎芯?觀察PNCB對核仁形態(tài)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),連續(xù)給予10μM PNCB有活化SN的趨勢,而連續(xù)給予40μM PNCB則抑制SN的活性。
　　 海兔衰老涉及一系列基因表達的變化,這些基因在不同神經(jīng)元的表達具有選擇性差異。利用實時定量PCR技術(shù)考察連續(xù)注射PNCB對

9、海兔衰老相關(guān)基因表達的影響,發(fā)現(xiàn)給予PNCB使K+channel在R2的表達、GluR5在R2的表達、FBL在R2和胸膜神經(jīng)節(jié)的表達減少,APP、FBL在LP11的表達增加。PNCB對不同基因的作用趨勢有所不同。
　　 以上研究結(jié)果提示,PNCB對經(jīng)典的神經(jīng)生物學(xué)研究模型海兔表現(xiàn)出一系列藥理作用。利用海兔模型研究PNCB對神經(jīng)功能的作用,有助于發(fā)現(xiàn)PNCB活性作用的特點,為研究PNCB的內(nèi)在活性及其在高等動物體內(nèi)的作用機制提供參

10、考依據(jù)。這一研究也提示,在藥物發(fā)現(xiàn)中綜合利用多種藥物模型乃至模式生物,對化合物的活性特點進行綜合考察,有助于提高活性化合物發(fā)現(xiàn)的效率。
　　 第三章匹諾塞林ADME/T的特點研究
　　 本節(jié)基于實驗室早期對PNCB藥代動力學(xué)性質(zhì)的考察結(jié)果,對PNCB的代謝、排泄、毒代動力學(xué)、人血漿蛋白結(jié)合率等進行了研究。
　　 PNCB首過效應(yīng)明顯,主要以Ⅱ相代謝產(chǎn)物的形式排泄。為了解釋PNCB最終去向的問題,為PNCB開發(fā)成藥

11、的提供安全性的相關(guān)數(shù)據(jù),本節(jié)利用體外肝微粒體蛋白/肝胞漿蛋白孵育體系建立了一種用于定量測定生物樣品中PNCB葡萄糖醛酸結(jié)合產(chǎn)物和硫酸結(jié)合產(chǎn)物的數(shù)學(xué)方法。該方法經(jīng)留一法交叉檢驗證實可靠。將這一模型應(yīng)用于PNCB的“物料平衡”研究,發(fā)現(xiàn)靜脈注射22.5mg/kg PNCB48h后,PNCB相關(guān)物質(zhì)基本從體內(nèi)排出,其中,約有40.5％的PNCB以代謝產(chǎn)物的形式從尿中排泄。
　　 在對連續(xù)給予比格犬PNCB的毒理學(xué)進行研究時,同時考察相

12、伴毒代動力學(xué)。結(jié)果表明:在5 mg/kg、20 mg/kg、80 mg/kg三個劑量下,連續(xù)29天給予PNCB,能夠增加原型藥物在動物體內(nèi)的暴露水平,其中低劑量組增加更顯著。80 mg/kg組在各組織中有一定蓄積,其中肝、腎殘留的PNCB最多。以上結(jié)果提示:在臨床試驗中應(yīng)注意藥物可能對肝臟和腎臟產(chǎn)生的毒性,以及可能出現(xiàn)的蓄積毒性。
　　 人血漿蛋白結(jié)合率的測定為藥物在機體內(nèi)的處置、藥物作用的發(fā)揮及可能出現(xiàn)的藥物相互作用提供參考信

13、息。本研究利用微量平衡透析法,測得PNCB與人血漿蛋白結(jié)合率約為96.9％。
　　 本章研究結(jié)果表明,在藥物發(fā)現(xiàn)過程中對化合物的ADME/T的特點進行考察,有助于明確化合物在機體內(nèi)的處置過程及終點,了解化合物潛在的毒性及可能存在的藥物相互作用,盡可能地在藥物發(fā)現(xiàn)的早期階段排除ADME/T性質(zhì)不佳的化合物,集中力量研究ADME/T性質(zhì)良好的化合物,從而節(jié)約研發(fā)成本、提高研發(fā)效率。
　　 第四章藥物晶型評價技術(shù)在新尼群地平研

14、究中的應(yīng)用
　　 本研究以NTD-Ⅰ為對照品,利用大鼠對NTD-Ⅳ原料藥的物理性質(zhì)和生物學(xué)性質(zhì)進行多方面的評價。粉末X-射線衍射和掃描電子顯微鏡的結(jié)果表明,NTD-Ⅳ是一種與NTD-Ⅰ晶型形態(tài)不同的新晶型NTD,NTD-Ⅳ在0.3％SDS溶液中的溶解速度、通過Caco-2單層細胞模型的轉(zhuǎn)運速度均高于NTD-Ⅰ。給予大鼠18mg/kg、90mg/kg、180mg/kg的NTD-Ⅳ,其在大鼠胃腸道的吸收速度和程度均高于相同劑量的晶Ⅰ

15、型。在18mg/kg的給藥劑量下,NTD-Ⅳ降低大鼠舒張壓和收縮壓的能力均強于晶Ⅰ型。
　　 以市售尼群地平片為對照品,利用比格犬對以NTD-Ⅳ為主要原料的新尼群地平片的相對生物利用度進行評價。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在9mg/kg NTD的給藥劑量下,新尼群地平片在比格犬胃腸道的吸收優(yōu)于市售尼群地平片。
　　 以上結(jié)果提示:從改善吸收、穩(wěn)定藥效等方面考慮,NTD-Ⅳ是一種優(yōu)于NTD-Ⅰ的新優(yōu)勢晶型,而新尼群地平片相對市售尼群地平片,是

16、一種生物利用度更高的制劑。
　　 本章研究表明,在藥物發(fā)現(xiàn)過程中應(yīng)用晶型技術(shù),有助于改善化合物的物質(zhì)形態(tài),在提高化合物穩(wěn)定性的同時,改善其溶解和吸收性質(zhì),保證藥效的穩(wěn)定發(fā)揮。而在晶型藥物的評價中,綜合應(yīng)用物理學(xué)、藥代動力學(xué)、生物學(xué)等方法,有助于了解晶型藥物的自身特點及作用特點,提高發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢藥物晶型的效率,并為進一步的藥物開發(fā)提供參考依據(jù)。
　　 綜上所述,本研究用活性評價、代謝分析等技術(shù)對通過靜脈注射給藥的化合物PNCB