2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、第一部分
   HCV(Ib型)NS5A真核表達(dá)載體構(gòu)建及凋亡相關(guān)基因表達(dá)譜芯片分析
   目的:構(gòu)建HCV(Ib型)NS5A真核表達(dá)載體pcDNA3.1/myc-His(-)-HCVNS5A,研究NS5A蛋白對人肝癌細(xì)胞凋亡相關(guān)分子表達(dá)的影響。
   方法:以丙肝患者血清HCV RNA(Ib型)為模板,逆轉(zhuǎn)錄PCR法獲取NS5A基因序列,再將該基因連到pGEM-TEasy載體上,經(jīng)XhoⅠ和HindⅢ雙酶切獲得

2、NS5A粘性末端,將NS5A粘性末端與同樣經(jīng)XhoⅠ和HindⅢ雙酶切的pcDNA3.1/myc-His(-)連接從而構(gòu)建成NS5A的真核表達(dá)載體。用Western blot法鑒定NS5A基因在人肝癌細(xì)胞系HepG2中的表達(dá)。將轉(zhuǎn)染了pcDNA3.1/myc-His(-)-HCV NS5A的HepG2進(jìn)行表達(dá)譜芯片分析。
   結(jié)果:構(gòu)建的真核表達(dá)載體經(jīng)雙酶切及測序鑒定正確無誤,轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞系后Western blot檢測

3、顯示HepG2大量表達(dá)myc-his-NS5A融合蛋白。芯片分析顯示11條與凋亡相關(guān)的基因出現(xiàn)差異表達(dá)其中5條基因表達(dá)上調(diào),6條表達(dá)下調(diào)。
   結(jié)論:成功構(gòu)建了Ib型HCV NS5A的真核表達(dá)載體,利用表達(dá)譜芯片分析發(fā)現(xiàn)NS5A對肝細(xì)胞凋亡的作用可能涉及死亡受體通路、線粒體凋亡通路、DNA修復(fù)機(jī)制。
   第二部分
   NS5ATP9抑制血清饑餓誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞凋亡
   目的:探討HCV NS5

4、A反式激活基因NS5ATP9對肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞凋亡的影響。
   方法:將NS5ATP9基因表達(dá)質(zhì)粒、NS5ATP9干擾RNA質(zhì)粒及各自的對照空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HepG2細(xì)胞系,48h后換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24h誘導(dǎo)凋亡,用實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染后NS5ATP9 mRNA表達(dá)水平的變化,用Annexin V/7AAD流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡,JC-1檢測線粒體膜電位,Western blot技術(shù)檢測Bax蛋白表達(dá),以觀察NS5

5、ATP9對HepG2細(xì)胞血清饑餓誘導(dǎo)凋亡的影響。
   結(jié)果:Annexin V/7AAD檢測結(jié)果顯示,NS5ATP9過表達(dá)組和對照組相比早期凋亡和總凋亡率顯著減少(P<0.05);而NS5ATP9干擾RNA組的早期凋亡、晚期凋亡和總凋亡率均顯著增加(P<0.05)。JC-1檢測結(jié)果顯示,NS5ATP9過表達(dá)組和對照組相比線粒體膜電位保持正常形式的比例增加(P=0.053),而出現(xiàn)去極化電位形式的比例顯著減少(P<0.05),△

6、ψm有增高趨勢(P=0.324);而NS5ATP9干擾RNA組線粒體膜電位保持正常形式的比例顯著減少(P<0.05),AVm有降低趨勢(P=0.378)。促凋亡分子Bax蛋白Western blot檢測結(jié)果顯示,NS5ATP9干擾RNA組Bax表達(dá)量顯著上升(P<0.05),NS5ATP9過表達(dá)組Bax表達(dá)量則有下降趨勢(P=0.551)。
   結(jié)論:NS5ATP9基因抑制血清饑餓誘導(dǎo)的HepG2凋亡,其機(jī)制可能是通過線粒體途

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