五組趨化軸在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向大鼠缺血區(qū)心肌趨化作用比較.pdf

1、目的：
　　初步比較五組趨化軸在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向大鼠缺血區(qū)心肌的趨化作用。
　　方法：
　　1、取6-8周齡SD大鼠的脛骨及股骨分離骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs），用全骨髓差異貼壁法培養(yǎng)及純化BMSCs，并取第3代BMSCs用于本實驗。用正常成年大鼠心肌制備心肌條件培養(yǎng)基模擬心肌微環(huán)境。BMSCs在低氧(3%O2)無血清心肌條件培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)6小時、12小時、18小時、24小時及48小時組；通過real time

2、PCR分別檢測常氧有血清對照組及以上各時間點BMSCs中CXCR4、CCR1、CCR2、CX3CR1及c-met的表達(dá)量。
　　2、通過開胸結(jié)扎SD大鼠左前降支（體重約250g）建立心梗模型，通過其下腔靜脈注射3%的伊文氏藍(lán)染色劑將心梗心肌分為缺血區(qū)心肌及非缺血區(qū)心肌，分別取未結(jié)扎大鼠正常心肌及心梗后1天，2天，3天，7天及14天心梗大鼠缺血區(qū)及非缺血區(qū)心肌各3只，通過real time PCR法或RT-PCR法分別檢測缺血區(qū)心肌

3、及非缺血區(qū)心肌SDF-1、MCP-1、HGF、Fractalkine及CLL7表達(dá)情況。
　　3、Transwell小室趨化實驗：根據(jù)前期實驗可知CXCR4、CCR2、CX3CR1表達(dá)持續(xù)升高，故在上層放置未經(jīng)或經(jīng) CXCR4拮抗劑 AMD3100處理過的含BMSCs（約2×105/ml）無血清心肌條件培養(yǎng)基，下層為正常心肌或SDF-1、Fractalkine、MCP-1達(dá)峰時即心梗后1天、3天及7天的缺血區(qū)心肌制備的含血清的心肌

4、條件培養(yǎng)基，在低氧條件下培養(yǎng)48小時，比較BMSCs遷移數(shù)量及AMD3100對BMSCs向心肌條件培養(yǎng)基趨化作用的影響。
　　結(jié)果：
　　1、BMSCs在缺血缺氧心肌條件培養(yǎng)基中CXCR4、CCR2、CX3CR1、c-met及CCR1表達(dá)變化
　　以常氧有血清培養(yǎng)的BMSCs為對照組，BMSCs在缺血缺氧心肌條件培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)6小時、12小時、24小時，36小時及48小時，其中CXCR4、CCR2及CX3CR1表達(dá)量

5、顯著增高，而CCR1及c-met表達(dá)量顯著降低。不同時間點CXCR4的mRNA表達(dá)量分別為正常對照的4.181±0.590倍、5.484±1.228倍、12.35±1.622倍、4.646±1.491倍及1.242±0.294倍；CCR2的 mRNA表達(dá)量分別為正常對照的3.095±0.177倍、5.003±0.576倍、4.245±0.885倍、8.575±6.065倍及3.288±1.506倍；CX3CR1的 mRNA表達(dá)量分別為正

6、常對照的6.455±0.957倍、11.99±1.918倍、6.762±1.241倍、7.411±3.378倍及0.162±0.022倍；CCR1的mRNA表達(dá)量分別為正常對照的0.202±0.248倍、0.125±0.101倍、0.042±0.022倍、0.050±0.026倍及0.078±0.059倍;c-met的 mRNA表達(dá)量分別為正常對照的0.409±0.143倍、0.272±0.178倍、0.077±0.054倍、0.086

7、±0.042倍及0.229±0.087倍。
　　2、心梗后心肌非缺血區(qū)及缺血區(qū)SDF-1、MCP-1、HGF、Fractalkine及CCL7表達(dá)變化
　　分別檢測正常大鼠心肌和大鼠心梗后1天、2天、3天、7天、14天非缺血區(qū)和缺血區(qū)SDF-1、MCP-1、HGF、Fractalkine及CCL7表達(dá)量。非缺血區(qū)心肌各組間均目的基因表達(dá)均無顯著性差異。心梗大鼠缺血區(qū)各時間點SDF-1 mRNA表達(dá)量分別是正常心肌的26.74

8、±4.957倍、17.41±2.357倍、8.138±1.083倍、2.493±0.898倍、1.918±0.977倍；MCP-1 mRNA表達(dá)量分別是正常心肌的0.623±0.014倍、2.722±0.379倍、2.816±0.722倍、4.879±0.862倍、1.593±0.528倍；HGF mRNA表達(dá)量分別是正常心肌的4.038±1.696倍、12.40±3.920倍、34.440±6.804倍、2.312±0.694倍、1.

9、736±1.618倍；Fractalkine mRNA表達(dá)量分別是正常心肌的0.523±0.294倍、3.497±1.926倍、35.94±11.02倍、4.893±0.203倍、2.588±0.845倍；CCL7 mRNA表達(dá)量分別是正常心肌的43.67±11.71倍、29.99±2.902倍、12.42±2.011倍、2.072±0.105倍、2.060±0.705倍。以上各組間表現(xiàn)出明顯的時序性變化。
　　3、體外遷移實驗：

10、
　　根據(jù)前期實驗，BMSCs在缺血缺氧心肌條件培養(yǎng)基中持續(xù)高表達(dá)的 CXCR4、CCR2、CX3CR1，所以我們選取了心梗后1天、3天及7天心肌缺血區(qū)組織，對與CXCR4、CCR2、CX3CR1相關(guān)3組趨化軸的趨化效果進(jìn)行對比。
　　正常心肌條件培養(yǎng)基組BMSCs遷移數(shù)為12.05±2.73個/HPF(高倍鏡)，與正常心肌條件培養(yǎng)基組相比心梗1天缺血區(qū)心肌條件培養(yǎng)基組BMSCs遷移數(shù)為70.80±7.918個/HPF（P<

11、0.05），心梗3天缺血區(qū)心肌條件培養(yǎng)基組BMSCs遷移數(shù)為39.20±5.933個/HPF（P<0.05），心梗7天缺血區(qū)心肌條件培養(yǎng)基組BMSCs遷移數(shù)為42.60±7.021個/HPF（P<0.05），加入AMD3100組的心梗1天缺血區(qū)心肌條件培養(yǎng)基組對BMSCs遷移數(shù)減少為32.20±6.140個/HPF，心梗3天缺血區(qū)心肌條件培養(yǎng)基組對BMSCs遷移數(shù)減少為26.6±4.278個/HPF，心梗7天缺血區(qū)心肌條件培養(yǎng)基組對BM

12、SCs遷移數(shù)減少為34.2±7.369個/HPF。
　　結(jié)論：
　　1、缺血缺氧心肌條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)BMSCs，其CXCR4、CCR2、CX3CR1表達(dá)量隨培養(yǎng)時間增加較對照組持續(xù)高表達(dá)，而c-met及CCR1表達(dá)量較對照組明顯降低。
　　2、心梗后大鼠非缺血區(qū)心肌SDF-1、MCP-1、HGF、Fractalkine及CCL7表達(dá)較正常組心肌無顯著性差異，而缺血區(qū)心肌SDF-1、MCP-1、HGF、Fractalki