胰島素抵抗動物模型Orexin-Leptin表達及其調(diào)控機制的分子生物學研究.pdf

1、胰島素抵抗(Insulin resistance,IR)是指由于胰島素在周圍組織攝取和清除葡萄糖的作用減低,使其不能發(fā)揮正常效應的病理生理狀態(tài).已有的研究表明,肥胖可以通過脂肪細胞胰島素受體、受體后結(jié)構(gòu)及表達的異常,最終將導致脂肪組織IR的發(fā)生,而IR又正是導致包括肥胖癥、糖尿病、高血壓病、動脈粥樣硬化癥、脂質(zhì)代謝異常等一系列病理狀態(tài)在內(nèi)的代謝綜合征的共同危險因素.由于這一惡性循環(huán)的存在,對肥胖及IR的研究已經(jīng)越來越成為眾多學者關(guān)注的熱

2、點.然而對肥胖機制的研究長期徘徊,直到1994年首次成功分離小鼠的肥胖相關(guān)基因(ob基因),并發(fā)現(xiàn)其編碼的蛋白質(zhì)Leptin,進而于1998年在尋找與孤兒G蛋白受體相連接的配基時,發(fā)現(xiàn)兩種神經(jīng)肽Orexin A和B,其中樞作用與Leptin截然相反,這樣,對肥胖相關(guān)激素和神經(jīng)肽的研究,才進入了嶄新的階段.目前已知Orexin/Leptin相互作用共同參與能量代謝及內(nèi)分泌等多種功能的調(diào)控.因此,該課題將研究重點確定為IR動物模型Orexi

3、n/Leptin表達及其調(diào)控機制的分子生物學研究.第一部分 膳食誘導胰島素抵抗大鼠模型建立及鉗夾技術(shù)評價 目的:該研究擬通過高果糖或高脂肪飼料喂養(yǎng),誘導建立IR大鼠模型,并采用判定IR模型是否復制成功的金標準,即高血漿胰島素-正常血糖鉗夾技術(shù)(Hyperinsulinemic egulycemic clamp technique,簡稱鉗夾技術(shù))對模型進行評價,確立成功復制和評價IR大鼠模型的有效方法.結(jié)論:1.該研究通過改變膳食結(jié)構(gòu)中碳

4、水化合物及脂肪熱卡比例,建立了高果糖及高脂肪膳食誘導IR大鼠模型.鉗夾技術(shù)證明大鼠GIR<,60-120>低于正常對照組,Ins敏感性下降,提示我們復制IR大鼠模型成功.2.建立了有效評價Ins敏感性的金標準-鉗夾技術(shù).該研究中GIR<,60-120>在5~12mg·kg<'-1>·min<'-1>范圍內(nèi),大鼠的凈輸入液體量為2~2.5ml,細胞外液量的改變?yōu)?~3％左右.這些指標均接近文獻報道,提示我們采用的鉗夾技術(shù)方法比較可靠、準確

5、、穩(wěn)定.而GIR<,60-120>與ISI間較好的相關(guān)性,提示我們在實驗條件有限的情況下,ISI也能夠較為客觀地反映機體胰島素的敏感性,尤其在流行病學調(diào)查等大樣本研究中,因其檢測技術(shù)簡便,具有很大的實用價值.3.兩種膳食誘導IR大鼠模型中,高脂肪膳食誘導模型的各項IR相關(guān)指標變化多數(shù)較高果糖膳食誘導模型更為明顯,提示我們高脂肪膳食在誘導IR模型中可能更為經(jīng)濟,更為可靠;而高果糖膳食模型成功的意義更傾向于對飲食結(jié)構(gòu)的重新認識,因為果糖正作

6、為減輕體重,鍛煉耐力,有益于糖尿病的健康飲食而被廣泛提倡,且有由西方人向東方人推廣的趨勢.第二部分 膳食誘導IR大鼠模型Orexin/Leptin系統(tǒng)及其影響因素的研究 目的:由于IR是導致包括肥胖癥、2型糖尿病的代謝綜合征的共同危險因素,因此,我們非常關(guān)注IR與Orexin/Leptin系統(tǒng)之間的相互關(guān)聯(lián).該研究擬采用RT-PCR方法對膳食誘導并經(jīng)鉗夾技術(shù)證實的IR動物模型中Orexin/Leptin及其受體mRNA表達情況進行檢測,

7、同時分析IR狀態(tài)下參與Orexin/Leptin系統(tǒng)調(diào)控的可能因素.結(jié)論:1.高果糖及高脂肪膳食誘導的IR大鼠模型中下丘腦prepro-orexin表達減少,OX<,1>R、OX<,2>R表達增加;脂肪組織中l(wèi)eptin mRNA表達增加,下丘腦leptin受體(LR)mRNA表達減少;其中,高脂肪膳食誘導IR大鼠模型中上述變化更為明顯,提示orexin與leptin是機體能量平衡調(diào)節(jié)網(wǎng)絡中的一對重要物質(zhì),二者相互調(diào)控共同維持機體能量代

8、謝的穩(wěn)定.Orexin與leptin相互調(diào)控機制的闡明,將有助于我們通過增加leptin和/或leptin的敏感性,應用選擇性的orexin受體拮抗劑,以達到治療肥胖和IR的目的.2.該模型中血清胰島素、葡萄糖、血脂水平及IR相關(guān)的重要指標:FFA、TNF-α等均可能成為與Orexin系統(tǒng)相互調(diào)控的內(nèi)分泌代謝因素,這些調(diào)控的深層次機制還有待于進一步的研究闡明.第三部分 葡萄糖對Orexin系統(tǒng)的調(diào)節(jié) 目的:Orexin除了參與攝食、睡眠

9、/覺醒的調(diào)控外,還是涉及內(nèi)分泌代謝調(diào)節(jié)的重要因素,尤其是Orexin與葡萄糖和胰島素之間的相互關(guān)聯(lián)因脂肪-胰島軸的存在,以及在肥胖癥、糖尿病發(fā)病和治療中的重要意義而倍加引人關(guān)注.因此,該文著重就葡萄糖對Orexin在中樞及周圍系統(tǒng)胰腺表達的調(diào)控及其作用機理加以闡述,希望可以確定如下幾個問題:1)胰島素介導的低血糖對大鼠下丘腦orexin系統(tǒng)表達的影響.2)胰腺組織中是否有prepro-orexin及其受體表達.3)胰腺中prepro-o

10、rexin及其受體表達是否被葡萄糖調(diào)節(jié).4)不同濃度葡萄糖對胰島細胞增殖情況的影響及意義.結(jié)論:1.急性Ins誘導低血糖伴禁食狀態(tài)刺激下丘腦prepro-orexin表達,但對受體OX<,1>R尤其是OX<,2>R表達影響不顯著,提示下丘腦Orexin神經(jīng)元被血糖下降激活,被與進食相關(guān)的信號抑制.因此,在維持葡萄糖可獲得性的"血糖穩(wěn)態(tài)"進食機制中,Orexin神經(jīng)元的作用顯示出十分重要的地位.2.原位雜交法證實胰島細胞胞漿中有prepr

11、o-orexin及OX<,1>R mRNA的表達,提示中樞神經(jīng)系統(tǒng)外Orexin的存在,且Orexin可以作為一個循環(huán)激素和/或自分泌及旁分泌物質(zhì)起作用,參與能量平衡及內(nèi)分泌代謝.3.胰腺中的Orexin神經(jīng)元與下丘腦及腸道中一樣,均是葡萄糖敏感的,是血糖水平下降時被活化的葡萄糖感覺網(wǎng)絡的一部分,當葡萄糖濃度改變時,培養(yǎng)胰島細胞中Orexin及其受體mRNA的表達發(fā)生相應改變.4.培養(yǎng)基中葡萄糖濃度的改變,將會影響胰島細胞的增殖情況,偏