SRB方法定量檢測(cè)體外誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞凋亡及人參皂甙對(duì)凋亡的影響.pdf

1、最近的研究表明角質(zhì)形成細(xì)胞的凋亡在濕疹性皮炎慢性化中起著關(guān)鍵的作用。角質(zhì)形成細(xì)胞的凋亡導(dǎo)致細(xì)胞間連接的破壞，真皮內(nèi)水分滲入表皮內(nèi)，在表皮內(nèi)形成海綿樣病變，這可以使皮膚的屏障功能受到損害，從而加重濕疹性皮炎。因此，角質(zhì)形成細(xì)胞的凋亡為濕疹性皮炎慢性化的轉(zhuǎn)折點(diǎn)，阻斷角質(zhì)形成細(xì)胞的凋亡可以減輕濕疹慢性化進(jìn)程的發(fā)生，從而為濕疹性皮炎的治療提供了一條新的途徑，成為藥物篩選的一個(gè)新靶點(diǎn)。流式細(xì)胞儀可以定量檢測(cè)細(xì)胞的凋亡，此方法雖然敏感準(zhǔn)確，但是需要

2、一定量的細(xì)胞和大量的試劑，并且操作復(fù)雜、耗時(shí)，不適合用于高通量的藥物篩選。SulphorhodamineB(SRB)和Microtetrazolium(MTT)方法是檢測(cè)細(xì)胞增殖情況的快速、簡(jiǎn)便的96孔板檢測(cè)方法，如果能區(qū)分出細(xì)胞的增殖抑制是由凋亡而不是壞死引起的，就可用此方法初步篩選抑制細(xì)胞凋亡的藥物。本實(shí)驗(yàn)中用干擾素-γ(IFN-γ)和抗Fas單克隆抗體(antiFasAb)共同作用誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT凋亡，部分模擬濕疹性皮炎

3、的發(fā)病機(jī)制，以用于篩選治療濕疹性皮炎的藥物。通過(guò)比較SRB和MTT兩種檢測(cè)方法選用更敏感、準(zhǔn)確的SRB方法以及用流式細(xì)胞儀同步監(jiān)測(cè)SRB檢測(cè)結(jié)果，建立了用SRB初步篩選抗細(xì)胞凋亡藥物的方法，從而為篩選濕疹性皮炎的治療藥物奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法：IFN-γ和antiFasAb單獨(dú)或聯(lián)合作用于體外培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞株HaCaT，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面Fas抗原的表達(dá)和細(xì)胞的凋亡情況并檢測(cè)caspase抑制劑z-VAD-FMK對(duì)HaC

4、aT細(xì)胞凋亡的影響。比較SRB和MTT方法在線(xiàn)性、日內(nèi)變異及日間變異上的差異，選用更精確的方法檢測(cè)HaCaT細(xì)胞的增殖情況。流式細(xì)胞儀同步檢測(cè)SRB方法的檢測(cè)結(jié)果，以確定用SRB方法篩選抑制角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT凋亡的人參皂甙。 結(jié)果：(1)流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示IFN-γ濃度分別為0ng/ml、1ng/ml、10ng/ml、25ng/ml、50ng/ml時(shí)，HaCaT細(xì)胞表面的Fas抗原表達(dá)分別49.66﹪±6.90、63.5

5、4﹪±6.38、71.41﹪±6.03、77.58﹪±5.92、79.31﹪±4.80。1ng/ml的IFN-γ上調(diào)Fas表達(dá)不明顯(P＞0.05)，但是10ng/ml以上濃度的IFN-γ可顯著增加Fas表達(dá)(P＜0.05)。(2)流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示50ng/ml的IFN-γ和25ng/ml的antiFasAb共同作用可以誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT凋亡，凋亡率可達(dá)到21.5﹪。Caspase抑制劑z-VAD-FMK可有效抑制IFN-

6、γ和antiFasAb共同作用引起的HaCaT細(xì)胞凋亡。(3)SRB方法和MTT方法都有非常好的線(xiàn)性，相關(guān)系數(shù)分別為0.99896和0.99724，兩種方法間無(wú)顯著性差異。SRB和MTT方法在日內(nèi)變異上無(wú)顯著性差異，而在日間變異上SRB方法小于MTT方法，兩種方法間有顯著性差異。(4)流式細(xì)胞儀與SRB方法同步檢測(cè)結(jié)果表明，固定IFN-γ濃度為50ng/ml，添加antiFasAb25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、0.5

7、μg/ml、1μg/ml時(shí)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)的細(xì)胞凋亡率分別為25.39﹪、24.39﹪、28.4﹪、31.58﹪、40.52﹪、46.67﹪，而SRB方法檢測(cè)的細(xì)胞增殖抑制率分別為29.8﹪、30.69﹪、32.79﹪、36.83、43.69、47.19﹪，兩種方法檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)系數(shù)為0.9934，應(yīng)用兩組間t檢驗(yàn)，P＞0.05,在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)顯著性差異。(5)人參皂甙Mx、CK和Re對(duì)HaCaT細(xì)胞凋亡有一定的抑制作用，抑制率分別為18

8、.4﹪、14.5﹪、9.6﹪。 結(jié)論：(1)IFN-γ和antiFasAb共同作用可誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT凋亡。(2)SRB方法比MTT方法更靈敏、更穩(wěn)定，更適合藥物的高通量篩選。(3)流式細(xì)胞儀與SRB方法同步檢測(cè)結(jié)果顯示，在明確細(xì)胞的增殖抑制是由凋亡而非壞死引起時(shí)，SRB方法可以用于凋亡的定量檢測(cè)，即SRB方法可用于初步篩選抑制細(xì)胞凋亡的藥物。(4)人參皂甙Mx，CK，和Re對(duì)IFN-γ和antiFasAb誘導(dǎo)的HaCa