新型MR網(wǎng)狀內(nèi)皮靶向?qū)Ρ葎〨d-PBCA納米微粒的合成及與SPIO在MR淋巴成像的對比研究.pdf

1、研究目的 一、制備Gd-DTPA聚氰基丙烯酸正丁酯納米微粒(Gd-PBCA-NP)，并優(yōu)選出最佳的制備方案； 二、在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中靜脈注射Gd-PBCA-NP，并與Gd-DTPA對照，考察Gd-PBCA-NP肝臟靶向強(qiáng)化效果，并探討其潛在的應(yīng)用價(jià)值； 三、組織間隙注射Gd-PBCA-NP，進(jìn)一步評估其淋巴組織靶向增強(qiáng)效果，并與SPIO網(wǎng)狀內(nèi)皮陰性對比劑對比，評估兩者在MR淋巴成像中對良、惡性淋巴結(jié)診斷和鑒別診斷的價(jià)值

2、。 材料和方法 一、Gd-PBCA-NP的制備及優(yōu)化 (一)制備工藝的確定 采用陰離子乳化聚合法，精密稱取一定量Gd-DTPA(V/V)、Dextron-70(W/V)，溶于雙蒸水中，用0.1NHCL調(diào)節(jié)PH于酸性狀態(tài)，在磁力攪拌器下緩慢加入一定量PBCA單體(V/V)，攪拌4h，然后加入一定量1NNaoH調(diào)節(jié)PH于7.0，反應(yīng)終止，隨后用0.45um微孔濾膜過濾，將濾液存于4℃冰箱內(nèi)備用。 (二

3、)單因素初選制備條件 在一定范圍內(nèi)，介質(zhì)的PH值、單體濃度、穩(wěn)定劑及藥物濃度是影響NP粒徑大小及其均勻度主要因素。固定其它三種因素于某一條件下，分別考察另一因素在不同條件下對Gd-PBCA-NP粒徑及其均勻度的影響。 (三)正交設(shè)計(jì)優(yōu)化制備條件 在單因素初選條件的基礎(chǔ)上，以包封率和載藥量為評價(jià)指標(biāo)，應(yīng)用L9(34)正交表安排實(shí)驗(yàn)(PH值、Gd-DTPA、PBCA、Dextran-704因素，3個(gè)水平)，優(yōu)化制備條

4、件。 (四)Gd-PBCA-NP粒徑及其分布的測定 用Malvern-3000HS激光粒度分析儀測定粒徑及其分布：吸取5ul制備的相應(yīng)樣品，用雙蒸水稀釋至量杯中。所選激光光源波長為633.0nm，測試溫度為25.00±0.05。 (五)Gd-PBCA-NP形態(tài)觀察 取少量上述混合液放置透析袋(截留分子量為1,000,000Da)內(nèi)，用5％葡萄糖溶液透析48h，除去游離Gd-DTPA、Dextron-70及

5、無機(jī)離子。用透射電鏡(日立H-600)觀察Gd-PBCA-NP大體形態(tài)。具體操作方法為：1∶4蒸餾水稀釋純凈Gd-PBCA-NP液體，取1滴放在鍍膜銅網(wǎng)上，濾紙吸去多余液體，加入2％磷鎢酸染30s，干燥后電鏡下觀察。 (六)Gd-PBCA-NP包封率及載藥量的測定 取5ml制備的混合液按上述方法透析，透析液總量為2000ml。取20ml透析液(含游離Gd-DTPA)送交廣州科學(xué)院分析測試中心，采用高頻電感耦合等離子發(fā)射光

6、譜法(ICP-AES)測定透析液中Gd離子濃度，按下式計(jì)算Gd-PBCA-NP的包封率及載藥量： 包封率=(Ca-Cs)/Ca×100％載藥量=(Ca-Cs)/CPBCA×100％Ca：母液Gd-DTPA濃度，Cs：透析液Gd-DTPA量CPBCA:母液PBCA濃度 二、Gd-PBCA-NP肝臟靶向性成像研究 (一)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 正常清潔級Wistar大鼠18只，雌雄各半，體重167.5±18.7g，采用隨機(jī)

7、數(shù)字法將其分為三組：1、Gd-DTPA對照組：劑量為0.1mmol/kg；2、PBCA-NP組：劑量為1ml/100g；3、Gd-PBCA-NP組：劑量為1ml/100g. (二)MRI掃描方法 MRI掃描(SiemensMagnetomVisionPlus1.5T)采用頭部線圈，冠狀及橫斷面掃描，掃描參數(shù)為Turbo-SET1WI(TR/TE=500ms/15ms)和T2WI(TR/TE=2000ms/90ms)。平掃

8、后，各組分別于注藥后5min、15min、30min、1h、2h增強(qiáng)掃描，掃描參數(shù)同平掃。 三、組織間隙注射Gd-PBCA-NP與SPIO在MR淋巴成像中對照研究 (一)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 健康成年新西蘭白兔24只，由第一軍醫(yī)大學(xué)附屬南方醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，體重2.0～2.5kg，采用隨機(jī)法分為2組：反應(yīng)性增生淋巴結(jié)組(n=12)、腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組(n=12)。 (二)圖像評估 1、在不同序列上測量平

9、掃、增強(qiáng)后腘窩淋巴結(jié)的信噪比。分別在T1WIFS、T2WI像上測量Gd-PBCA-NP、SPIO增強(qiáng)后反應(yīng)性增生淋巴結(jié)組在各時(shí)間點(diǎn)的強(qiáng)化率。在T1WIFS像上，測量各組腘窩淋巴結(jié)的大小。觀察各組增強(qiáng)后淋巴管形態(tài)并計(jì)算淋巴管的顯示數(shù)量。 2、采用雙盲法評估Gd-PBCA-NP、SPIO對診斷腫瘤轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)的敏感性、特異性、假陽性率、假陰性率。腫瘤轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)的具體診斷標(biāo)準(zhǔn)為：(1)Gd-PBCA-NP增強(qiáng)：在T1WI或T1WIF

10、S上，與平掃相比，淋巴結(jié)信號不均勻升高或保持不變，診斷為惡性，如信號均勻升高則診斷為良性； (2)SPIO增強(qiáng)：在T2WI或T2*WI像上，與平掃相比，淋巴結(jié)信號不均勻降低或保持不變，診斷為惡性，如信號均勻降低則診斷為良性。 (三)病理組織學(xué)檢查 所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在完成MRI增強(qiáng)掃描后，用放血法處死動(dòng)物，仔細(xì)暴露腘窩淋巴結(jié)，摘除并測量淋巴結(jié)的短徑，計(jì)算淋巴結(jié)數(shù)目。行H-E染色觀察淋巴結(jié)形態(tài)和結(jié)構(gòu)的變化，判別其良惡性。

11、 結(jié)果 一、在一定范圍內(nèi)，Gd-PBCA-NP粒徑隨PBCA單體濃度的增加而增加，隨PH增加而增加，隨Dextran-70濃度增加而降低，Gd-DTPA濃度對Gd-PBCA-NP粒徑無顯著影響。 二、正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明溶液的PH值對Gd-PBCA-NP包封率和載藥量的影響最顯著，Gd-DTPA濃度影響因素最小，Dextran-70濃度和PBCA濃度在選定范圍內(nèi)差異不明顯。確定最佳制備條件為：PH值為2.5，Dext

12、ran-70濃度為1.5％，PBCA濃度為2.0％，Gd-DTPA濃度為20％。 三、透射電鏡觀察Gd-PBCA-NP呈類圓形，大小均勻，表面平滑完整，粒子之間無粘連，具有明顯的核-殼結(jié)構(gòu)。 四、激光粒度分析儀測定Gd-PBCA-NP平均粒徑為65.7nm，粒徑分布為0.09。五、優(yōu)化制備條件下Gd-PBCA-NP的平均包封率和載藥量分別為81.97％、51.23％。 六、Gd-PBCA-NP靜脈注射靜注后5mi

13、n肝實(shí)質(zhì)SNR與平掃相比無顯著性差異；15min，30min，1h，2h肝實(shí)質(zhì)SNR與平掃相比有顯著性差異。肌肉在各時(shí)間點(diǎn)與平掃相比無顯著性差異。靜脈注射Gd-DTPA后，在第5min、10min肝臟SNR較高，而第30分鐘、1h、2h同增強(qiáng)前肝臟SNR基本處于同一水平。PBCA-NP靜脈注射后在各時(shí)間點(diǎn)肝實(shí)質(zhì)、肌肉SNR與平掃對比無顯著性差異。 七、靜脈注射Gd-DTPA后5min、15min肝實(shí)質(zhì)強(qiáng)化程度平均為35.2％、4

14、8.6％同時(shí)可見腎實(shí)質(zhì)也明顯強(qiáng)化，30min，肝實(shí)質(zhì)信號強(qiáng)度恢復(fù)到平掃前水平。靜注Gd-PBCA-NP后5min，肝實(shí)質(zhì)強(qiáng)化程度平均為3.4％，15min、30min、1h、2h肝實(shí)質(zhì)強(qiáng)化程度平均為22.7％，36.1％、56.4％、24.8％，與Gd-DTPA組、PBCA-NP組肝實(shí)質(zhì)強(qiáng)化方式明顯不同。 八、反應(yīng)性增生淋巴結(jié)和腫瘤轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)均制作成功，平掃兩組腘窩淋巴結(jié)在各序列圖像上的SNR、大小均無顯著性差異，但腫瘤轉(zhuǎn)移性

15、淋巴結(jié)平均直徑大于反應(yīng)性增生淋巴結(jié)。 一.Gd-DTPA-NP粒徑與PH值、單體濃度呈正相關(guān)，與Dextran-70濃度呈負(fù)相關(guān)。 二.優(yōu)化Gd-DTPA-NP的制備條件為：PH值為2.5，Dextran-70濃度為1.5％，PBCA濃度為2.0％，Gd-DTPA濃度為20％。Gd-DTPA-NP包封率及載藥量分別為81.97％、51.23％，粒徑為65.7nm，大體形態(tài)呈類圓形，具有明顯的核-殼結(jié)構(gòu)。 三、靜脈

16、注射Gd-PBCA-NP后，在T1WI像上大鼠肝臟呈靶向性強(qiáng)化，說明Gd-PBCA-NP可以作為MR網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞特異性對比劑。 四、靜脈注射Gd-PBCA-NP后，大鼠肝臟最大強(qiáng)化幅度達(dá)56.4％，強(qiáng)化峰值出現(xiàn)在24h左右。 五、MRI平掃難以準(zhǔn)確區(qū)分反應(yīng)性增生淋巴結(jié)和腫瘤轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)。六、與SPIO類似，Gd-PBCA-NP組織間隙注射可用來進(jìn)行MRI淋巴造影。 七、組織間隙注射Gd-PBCA-NP后，反應(yīng)性淋