組織工程真皮修復(fù)糖尿病裸鼠皮膚缺損的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、隨著生活水平提高，生活模式改變及社會(huì)老齡化，糖尿病發(fā)病率逐年增高。糖尿病皮膚潰瘍?yōu)樘悄虿〕Ｒ?jiàn)并發(fā)癥之一，多與糖尿病病程、病情關(guān)系密切。目前對(duì)于糖尿病皮膚潰瘍，臨床上常規(guī)治療為控制感染、血管重建、減壓治療和清創(chuàng)術(shù)。但常規(guī)的治療并不能取得令人滿意的治療效果。近年來(lái)隨著組織工程學(xué)的建立和發(fā)展，并且在臨床各個(gè)領(lǐng)域成功應(yīng)用，使糖尿病皮膚潰瘍的治療方法有了更多新的選擇。 治療糖尿病皮膚潰瘍的組織工程皮膚的類型主要有以下幾種：?jiǎn)渭儾牧辖Y(jié)合/不

2、結(jié)合生長(zhǎng)因子，含細(xì)胞的三維支架材料復(fù)合物。各種生長(zhǎng)因子在創(chuàng)面愈合過(guò)程中起到了一個(gè)關(guān)鍵的核心作用。由于生長(zhǎng)因子本身是一種蛋白質(zhì)成分，糖尿病創(chuàng)面本身各種蛋白酶活性相應(yīng)增強(qiáng)，生長(zhǎng)因子會(huì)很快被創(chuàng)面中各種蛋白酶降解清除進(jìn)而達(dá)不到其起作用所需要的濃度范圍；另一方面，各種生長(zhǎng)因子高昂的價(jià)格也是不得不考慮的一個(gè)方面。而結(jié)合細(xì)胞的三維支架材料復(fù)合物，由于構(gòu)建的復(fù)合物中細(xì)胞能有效地分泌各種生長(zhǎng)因子，成為人們進(jìn)一步研究的方向。 糖尿病模型的制備方法目

3、前主要有，手術(shù)切除胰腺、化學(xué)藥物誘導(dǎo)、自發(fā)性糖尿病動(dòng)物模型、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等。目前糖尿病模型制備以化學(xué)藥物誘導(dǎo)最為常見(jiàn)，其化學(xué)藥物包括四氧嘧啶（Alloxan）和鏈脲佐菌素（STZ）。四氧嘧啶具有價(jià)格低廉、來(lái)源廣泛等優(yōu)勢(shì)。但其同時(shí)也造成肝、腎等組織出現(xiàn)中毒性損壞，而且部分模型出現(xiàn)自發(fā)緩解情況。而STZ是具有特異性破壞胰腺β細(xì)胞，引起胰島素分泌降低，血糖增高。并且其所建立模型穩(wěn)定，對(duì)肝腎等組織損壞性小。為避免組織工程中的人體細(xì)胞在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)

4、生免疫排斥反應(yīng)，裸鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物成為一種很好的選擇。 因此，我們探討以小兒包皮真皮成纖維細(xì)胞為種子細(xì)胞，PGA為支架材料，應(yīng)用組織工程方法構(gòu)建組織工程真皮。我們通過(guò)對(duì)裸鼠腹腔注射STZ，誘導(dǎo)糖尿病裸鼠模型形成。進(jìn)而應(yīng)用構(gòu)建好的組織工程真皮，進(jìn)行研究修復(fù)糖尿病裸鼠皮膚缺損的可能性。 目的: 探討應(yīng)用小兒包皮真皮成纖維細(xì)胞作為種子細(xì)胞、PGA作為支架材料構(gòu)建組織工程真皮，修復(fù)糖尿病裸鼠皮膚缺損的可行性。 方法

5、: 1．PGA支架材料與成纖維細(xì)胞構(gòu)建真皮替代物的實(shí)驗(yàn)研究：小兒包皮真皮中分離的成纖維細(xì)胞，進(jìn)行傳代擴(kuò)增，觀察不同代次細(xì)胞體外增殖能力。將成纖維細(xì)胞接種PGA支架材料上。掃描電鏡觀察細(xì)胞材料粘附情況，H.E.染色對(duì)其進(jìn)行組織形態(tài)觀察。用Hoechst方法檢測(cè)其生長(zhǎng)曲線。檢測(cè)細(xì)胞材料復(fù)合物中分泌細(xì)胞外基質(zhì)情況：GAG和總膠原含量。檢測(cè)細(xì)胞材料復(fù)合物分泌生長(zhǎng)因子情況：TGF－β1、VEGF和bFGF。 2．建立糖尿病裸鼠模型

6、的實(shí)驗(yàn)研究：應(yīng)用STZ對(duì)裸鼠進(jìn)行腹腔注射，誘導(dǎo)產(chǎn)生糖尿病裸鼠模型。對(duì)誘導(dǎo)的糖尿病裸鼠模型進(jìn)行血糖動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。對(duì)糖尿病模型裸鼠和正常裸鼠的胰腺取材，進(jìn)行H.E.染色觀察對(duì)比。驗(yàn)證誘導(dǎo)糖尿病裸鼠皮膚具有創(chuàng)面難愈性：對(duì)糖尿病裸鼠及正常裸鼠皮膚糖含量進(jìn)行檢測(cè)及對(duì)比觀察；對(duì)糖尿病裸鼠及正常裸鼠進(jìn)行制造皮膚創(chuàng)面，以對(duì)創(chuàng)面愈合情況進(jìn)行觀察和對(duì)比。 3．構(gòu)建真皮替代物修復(fù)糖尿病裸鼠皮膚缺損的實(shí)驗(yàn)研究：以小兒真皮成纖維細(xì)胞為種子細(xì)胞，以PGA為支架

7、材料，構(gòu)建真皮替代物，對(duì)糖尿病裸鼠皮膚缺損進(jìn)行修復(fù)。以小兒真皮成纖維細(xì)胞/PGA復(fù)合物為實(shí)驗(yàn)組，以單純PGA材料為對(duì)照組，觀察創(chuàng)面愈合時(shí)間、創(chuàng)面愈合比例，術(shù)后4周取材 ，H.E染色觀察再生真皮層厚度、苦味酸染色觀察膠原纖維分布及含量。 結(jié)果: 1．PGA支架材料與成纖維細(xì)胞構(gòu)建真皮替代物的實(shí)驗(yàn)研究：掃描電鏡觀察細(xì)胞在材料上生長(zhǎng)良好，分泌細(xì)胞外基質(zhì)豐富，并隨時(shí)間進(jìn)展，細(xì)胞逐漸融合，細(xì)胞外基質(zhì)分泌逐漸增多。H.E染色觀察成纖

8、維細(xì)胞均勻分布于真皮替代物中。細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)定表明細(xì)胞在材料上生長(zhǎng)良好。細(xì)胞外基質(zhì)分泌表達(dá)檢測(cè)，GAG及膠原總含量隨著時(shí)間逐漸增加?？梢?jiàn)檢測(cè)到細(xì)胞分泌生長(zhǎng)因子TGF－β1及VEGF，但未能檢測(cè)到bFGF。 2．建立糖尿病裸鼠模型的實(shí)驗(yàn)研究：分別以0、100mg、150mg、200mg/Kg的劑量腹腔注射STZ，實(shí)驗(yàn)證明對(duì)于裸鼠進(jìn)行STZ一次性腹腔注射的合適劑量為150mg/Kg。成模后裸鼠出現(xiàn)多飲、多食、多尿等糖尿病的臨床癥狀。

9、糖尿病裸鼠胰腺病理H.E染色切片和正常裸鼠相比，胰島細(xì)胞出現(xiàn)數(shù)目減少、細(xì)胞變性壞死等現(xiàn)象。糖尿病裸鼠皮膚糖含量檢測(cè)，同正常裸鼠相比，糖尿病裸鼠皮膚糖含量明顯增加，并與血糖值存在正相關(guān)性。皮膚創(chuàng)面缺損相關(guān)研究，可觀察到糖尿病裸鼠皮膚創(chuàng)面愈合率明顯小于正常裸鼠。 3．構(gòu)建真皮替代物修復(fù)糖尿病裸鼠皮膚缺損的實(shí)驗(yàn)研究：觀察成纖維細(xì)胞/PGA復(fù)合物修復(fù)糖尿病裸鼠皮膚缺損，真皮替代物組創(chuàng)面愈合時(shí)間明顯短于單純PGA組和空白對(duì)照組，創(chuàng)面愈合比

10、例加快。HE染色觀察，真皮替代物組再生真皮層厚度明顯高于單純PGA組和空白對(duì)照組?？辔端崛旧^察可見(jiàn)真皮替代物組膠原纖維比單純PGA組和空白對(duì)照組較厚并且排列規(guī)則。 結(jié)論: 1．PGA具有良好的細(xì)胞相容性，兒童包皮真皮成纖維細(xì)胞能在其上較好的粘附和生長(zhǎng)，能夠分泌細(xì)胞外基質(zhì)如GAG及膠原，并能分泌生長(zhǎng)因子TGF－β1和VEGF。 2．通過(guò)腹腔注射一定劑量的STZ能夠誘導(dǎo)出糖尿病裸鼠模型，具備糖尿病臨床癥狀，胰島細(xì)胞