調節(jié)自噬表達對A549細胞放療敏感性改變的作用及機制研究.pdf

1、肺癌細胞的生物學發(fā)生是一個十分復雜的過程。尋找有效的抗癌方法與途徑，在肺癌的發(fā)生階段可以修復細胞成分的早期改變，肺癌形成之后能夠清除突變或者損傷了的細胞器，甚至在肺癌形成后逆轉肺癌細胞一直是近年來的研究熱點。 近年來的研究顯示：細胞器的代謝主要依靠自噬途徑。在生命的進化過程中，自噬是一個古老的生物學現(xiàn)象，廣泛存在于植物和其它較低級生命體中，是生物降解胞內(nèi)蛋白，完成細胞器轉化，保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要方式，也是哺乳動物清除癌細胞的手段

2、之一。自噬是一個有大量小分子蛋白質參與的生物學過程，人類自噬過程中比較明確的和研究較多的是Beclin1基因和其編碼蛋白。自噬體形成必需的微管相關蛋白輕鏈3（MAPLC3)也常常用于自噬體的檢測。 出于維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的目的，正常情況下細胞自噬的基礎水平保持在一個較低的狀態(tài)，在某些“危機”狀況下可以快速上調，如：生長激素缺乏、饑餓、細胞重建、細胞內(nèi)出現(xiàn)過多的受損細胞器或代謝廢物等。自噬受兩種進化中形成的營養(yǎng)感受器調節(jié)：TOR激

3、酶（target of rapamycin(TOR) kinase）在營養(yǎng)充分時關閉自噬信號，真核起始因子2 激酶Gcn2（eukaryotic initiation factor 2(eIF2) kinase Gcn2）及其下游靶位Gcn4－自噬基因的轉錄反式作用子，在饑餓時啟動自噬信號。TOR激酶的下游是一些編碼ATG蛋白的基因，參與自噬的發(fā)生，融合，成熟，再循環(huán)。雷帕霉素是TOR受體的拮抗劑，因此能夠上調自噬。另外較常用3甲基腺嘌

4、啉（3MA）抑制自噬。 自噬和癌細胞的形成、轉化、治療敏感性密切相關。癌細胞形成早期刺激自噬能夠清除受損細胞器，分解細胞內(nèi)過多的有害物質（如過氧化物等），阻止正常細胞向癌細胞轉化，調控自噬的表達和化療藥物聯(lián)合對腫瘤細胞的生長有協(xié)同或拮抗作用，表現(xiàn)為與單純用化療藥物相比，調控自噬表達后腫瘤細胞的凋亡率發(fā)生了變化。在化療或放療中抑制自噬有可能導致癌細胞無法清除受損細胞器，加速細胞死亡，強化治療效果。 為了研究自噬和非小細胞肺癌

5、的關系，以及調節(jié)自噬的表達可能產(chǎn)生的放療增敏效果，本研究檢測了經(jīng)手術切除的非小細胞肺癌（NSCLC）臨床標本中的自噬相關基因表達狀態(tài)，探討自噬的表達情況和NSCLC發(fā)生和發(fā)展的可能關系；觀察了肺癌細胞系A549在γ射線照射下自噬和自噬上游信號傳導系統(tǒng)的改變；研究了改變肺腺癌細胞系A549中自噬表達后，A549細胞對于放射治療敏感性的變化以及自噬相關通道蛋白和一些耐藥基因改變，檢驗腫瘤細胞周期和凋亡率，進而對其機制進行探討，探究自噬與凋亡

6、的內(nèi)在聯(lián)系和在程序性細胞死亡（PCD）的作用和意義。 本研究中，采集了2006年4月至2006年10月武漢協(xié)和醫(yī)院胸外科手術切除的非小細胞肺癌新鮮標本72例，冰凍病理切片免疫熒光染色檢測肺癌組織，癌旁組織，正常組織中自噬特異性基因Beclin1和MAPLC3表達；提取總蛋白和總RNA，采用Westernblot和RT-PCR檢測Beclin1和MAPLC3蛋白表達和mRNA轉錄情況并且進行半定量分析。培養(yǎng)肺腺癌細胞系A549，對

7、其采用γ射線照射，檢測在射線作用下自噬相關蛋白和mRNA以及上游akt和mTOR的表達。用3甲基腺嘌呤（3-methyladenine 3MA）和雷帕霉素（Rapamycin）改變其自噬的表達（3MA抑制自噬表達，Rapamycin則上調自噬表達），收集細胞后檢測不同自噬表達狀態(tài)下其抑制率和細胞凋亡率，以及細胞周期改變情況；細胞集落試驗檢測不同自噬表達情況下射線對細胞增殖的抑制情況；Western blot檢測MAPLC3、pakt、m

8、TOR、COX2等蛋白表達，RTPCR檢測MAPLC3、survivin、mTOR、Bcl-2、EIF-4E的mRNA轉錄情況水平。Beclin1和MAPLC3免疫熒光染色流式細胞檢測A549細胞自噬相關蛋白表達率，分析凋亡和自噬在PCD中的關系。 對NSCLC臨床切除標本免疫熒光染色和蛋白mRNA檢測顯示，Beclin1和MAPLC3在肺癌組織中表達低于在癌旁組織和非癌組織，而癌旁組織和正常組織中表達差異無統(tǒng)計學意義。Γ射線能