mmu-miR-335與小鼠精子活力及受精能力關(guān)系的研究.pdf

1、在我國(guó)每年出生的約2000萬(wàn)嬰兒中，神經(jīng)管畸形、先天性心臟病、唇腭裂等先天殘疾兒童數(shù)高達(dá)80萬(wàn)～120萬(wàn)，約占每年出生人口總數(shù)的4％～6％。其中大多數(shù)出生缺陷屬于多因素疾病，受遺傳因素和環(huán)境因素的共同影響。然而，出生缺陷的病因?qū)W及發(fā)病機(jī)理至今尚不完全清楚。最新研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)體某些結(jié)構(gòu)和功能的變化，乃至疾病的發(fā)生，并非基因本身發(fā)生了改變，而是基因的表觀遺傳修飾發(fā)生了變化，其中微小RNA（miRNA）在基因表達(dá)和調(diào)控中扮演著重要角色，miRN

2、A可調(diào)控生殖細(xì)胞的減數(shù)分裂，影響配子的生長(zhǎng)發(fā)育，參與植入前胚胎早期發(fā)育時(shí)序的調(diào)節(jié)，干預(yù)植入過(guò)程中相關(guān)基因的表達(dá)。本研究通過(guò)構(gòu)建mmu-miR-335過(guò)表達(dá)及沉默質(zhì)粒，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染昆明小鼠精子后，研究mmu-miR-335對(duì)精子活力、精卵結(jié)合及受精能力的影響。
　　【材料和方法】
　　1.材料：（1）CMV/GFP/Neo質(zhì)粒；（2）293T細(xì)胞；（3）精子，取自性成熟的雄性健康昆明小鼠；（4）卵母細(xì)胞，取自性成熟的雌性健康昆

3、明小鼠。
　　2.方法：（1）mmu-miR-335過(guò)表達(dá)和沉默質(zhì)粒構(gòu)建：用酶切、PCR和基因測(cè)序3種方法鑒定重組質(zhì)粒是否構(gòu)建成功；（2）細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染：觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)，檢測(cè)mmu-miR-335過(guò)表達(dá)和沉默質(zhì)粒能否在真核細(xì)胞中表達(dá)；（3）熒光原位雜交：設(shè)計(jì)5’端FITC標(biāo)記的mmu-miR-335探針，oligo合成，定位miR-335在成熟精子中的位置；（4）精子活力檢測(cè)：脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染小鼠精子mmu-miR-335過(guò)表

4、達(dá)及沉默質(zhì)粒后顯微鏡下鏡檢精子活力；（5）精卵吸附實(shí)驗(yàn)：洗滌后的昆明小鼠精子，于獲能培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)染mmu-miR-335過(guò)表達(dá)及沉默質(zhì)粒1 h后，體外受精，受精1 h后吸取卵母細(xì)胞壓片，計(jì)數(shù)卵母細(xì)胞周圍吸附精子數(shù)。對(duì)照組一為未經(jīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的正常精子，對(duì)照組二為轉(zhuǎn)染空載體精子組；（6）體外受精：洗滌后的昆明小鼠精子，于獲能培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)染mmu-miR-335過(guò)表達(dá)及沉默質(zhì)粒1 h后，與正常促排卵卵子進(jìn)行體外受精，24 h后計(jì)算受精卵得率。對(duì)照組

5、一為未經(jīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的正常精子，對(duì)照組二為轉(zhuǎn)染空載體精子組。
　　【結(jié)果】
　　1．酶切、PCR和基因測(cè)序結(jié)果表明mmu-miR-335過(guò)表達(dá)及沉默質(zhì)粒成功構(gòu)建；
　　2．將mmu-miR-335過(guò)表達(dá)質(zhì)粒及沉默質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48小時(shí)后見綠色熒光蛋白的表達(dá)，說(shuō)明所構(gòu)建質(zhì)粒可正常表達(dá)；
　　3．熒光原位雜交見精子赤道部核周隙出現(xiàn)mmu-miR-335雜交信號(hào)；
　　4．轉(zhuǎn)染mmu-miR-335過(guò)表達(dá)

6、及沉默質(zhì)粒后，昆明小鼠精子活力無(wú)顯著性差異；
　　5．轉(zhuǎn)染mmu-miR-335過(guò)表達(dá)及沉默質(zhì)粒后，昆明小鼠精子精卵結(jié)合能力無(wú)顯著性差異；
　　6．轉(zhuǎn)染mmu-miR-335過(guò)表達(dá)及沉默質(zhì)粒的精子與卵子體外受精后，受精卵得率無(wú)顯著性差異。
　　【結(jié)論】
　　1．成功地構(gòu)建了mmu-miR-335過(guò)表達(dá)及沉默質(zhì)粒；
　　2．mmu-miR-335過(guò)表達(dá)及沉默質(zhì)粒可以在真核細(xì)胞中表達(dá)；
　　3．可在精子赤