基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑分子生物色譜篩選方法的研究和應(yīng)用.pdf

1、目的：惡性腫瘤能浸潤其它組織并形成瘤塊，是引起人類死亡的重大疾病之一。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞產(chǎn)生和釋放多種水解酶降解細胞外基質(zhì)（ECM）或基底膜（BM）可能是浸潤與轉(zhuǎn)移的主要內(nèi)容。以明膠酶為靶點來設(shè)計、合成明膠酶抑制劑已經(jīng)成為抗癌藥物研究的熱點課題。本文建立了固定化明膠酶分子生物色譜法，并應(yīng)用于一批化合物的篩選。 方法：分別選擇色譜硅膠、整體柱為兩種載體，制備固定化明膠酶反應(yīng)器。以硅膠為載體的固定化明膠酶反應(yīng)器的制備：L8（27）正

2、交試驗考察固定化明膠酶的制備條件，考察因素包括明膠酶濃度、明膠酶量、緩沖溶液濃度以及pH，考察指標為鍵合率、酶活性，之后考察固定化明膠酶最佳活性條件。在柱上經(jīng)鍵合、沖洗、飽和，將明膠酶鍵合到分別含環(huán)氧基或醛基的色譜硅膠上，計算鍵合率。通過接取流出液比色和加入抑制劑比較產(chǎn)物峰面積變化兩種方法確定產(chǎn)物峰的位置，考察流速對產(chǎn)物的影響，測定酶的特征參數(shù)——Km，考察柱子的穩(wěn)定性。以整體柱為載體的固定化明膠酶反應(yīng)器的制備：采用溶膠．凝膠法，TMO

3、S為硅膠原料，PEG為相分離促進劑，乙酸、氨水和DMF分別作為水解催化劑、中孔制孔劑和干燥控制劑制備整體柱。從凝膠化時間、TMOS/PEG、制孔劑濃度和陳化時間等方面考察制備工藝，以骨架和通孔尺寸、中孔尺寸、硅羥基含量等作為考察指標。經(jīng)聚四氟乙烯包覆安裝于色譜系統(tǒng)中，測得孔隙率。再通過環(huán)氧基或醛基偶聯(lián)將明膠酶鍵合到整體柱上，進樣底物，確定產(chǎn)物峰的位置，考察酶濃度對鍵合率影響、流速對產(chǎn)物的影響，測定其Km，考察柱子穩(wěn)定性。篩選抑制劑：以L

4、Y52為陽性對照，用以上建立的方法測定其IC50，與文獻值和比色法測定值比較，同時制作量—效曲線，驗證篩選模型的可行性，并考察精密度。用該兩種色譜法測定另外439個化合物的IC50，并與比色法比較。 結(jié)果：正交設(shè)計試驗所得固定化明膠酶制備條件為：明膠酶0．5mg/mL，緩沖液0．05mol/L，pH6．0，固定化明膠酶最佳活性條件為：底物300μl、pH8．5、42℃。明膠酶與硅膠反應(yīng)的鍵合率分別為28．6mg/g（環(huán)氧基）、6

5、8．4 mg/g（醛基）。確定保留時間為37．631min的峰為產(chǎn)物峰，最佳流速為0．2mL/min，Km分別為0．63±0．006mmol/L（環(huán)氧基）、0．54±0．012mmol/L（醛基），柱子在一周內(nèi)穩(wěn)定。綜合比較鍵合率、Km、穩(wěn)定性發(fā)現(xiàn)，醛基為活性基團制備固定化酶反應(yīng)器更好。溶膠—凝膠法制備整體柱的條件為：TMOS/PEG3．77；120℃1．0mog/L氨水處理；陳化一天，所得整體柱骨架尺寸1．3μm、通孔尺寸2．5μm、

6、中孔尺寸14nm、比表面積264m2/g、硅羥基0．2377 mmol/g、孔隙率81％。明膠酶與整體柱鍵合，酶濃度以0．3mg/mL最佳，鍵合率分別為88．6mg/g（環(huán)氧基）、90．4 mg/g（醛基）。確定37．409min峰為產(chǎn)物峰，最佳流速為0．2mL/min，Km分別為0．28±0．005mmol/L（環(huán)氧基）、0．21±0．008mmol/L（醛基），柱子在一個月內(nèi)穩(wěn)定。綜合比較鍵合率、Km、穩(wěn)定性發(fā)現(xiàn)，兩種活性基團差別不

7、大，因環(huán)氧基制備簡單，選擇環(huán)氧基偶聯(lián)整體柱制備固定化酶反應(yīng)器。色譜法測定LY52的IC50分別為0．018±0．0001μmol/L（色譜硅膠）、0．021±0．0001μmol/L（整體柱），比色法測得值和文獻值分別為0．023±0．0004μmol/L、0．027±0．0004μmol/L，三者基本一致，量—效關(guān)系也良好，表明篩選模型是可行的。對另外39個化合物，兩種色譜法和比色法測定結(jié)果整體趨勢保持一致，但總體上以硅膠為載體的色譜