HCV E2與CD81結(jié)合對Raji細(xì)胞調(diào)節(jié)及干擾素α對人肝癌細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的影響.pdf

1、丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)是有包膜的單股正鏈RNA病毒，屬于黃病毒科。HCV基因組長約9.6 kb，有一個開放閱讀框架，編碼的多聚蛋白前體在病毒和宿主蛋白酶的作用下形成結(jié)構(gòu)蛋白(核心蛋白C以及糖基化的包膜蛋白E1、E2)和非結(jié)構(gòu)蛋白(p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)。全世界HCV感染者約1.7億，感染導(dǎo)致的慢性肝臟疾病是一個嚴(yán)重的全球性的公共衛(wèi)生難題，目前還沒有疫苗上市。HC

2、V兩條高度N-糖基化的糖蛋白E1、E2組成病毒體包膜蛋白并形成異二聚體，作為與宿主細(xì)胞受體互作的配體。
　　 一、丙型肝炎病毒E2蛋白結(jié)合CD81分子對Raji細(xì)胞激活的調(diào)節(jié)
　　 人CD81分子是HCV的細(xì)胞表面受體，可結(jié)合HCVE2蛋白。事實(shí)上HCV假病毒顆粒(HCVpp)，細(xì)胞培養(yǎng)的HCV(HCVcc)和所有血漿來源的HCV的感染性均源自與宿主表面CD81等受體分子的結(jié)合。CD81分子為四次跨膜素家族成員，有兩個胞

3、外環(huán)，分布于包括B、T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞、肝細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞表面，與細(xì)胞的活化、增殖、粘附等生物學(xué)功能密切相關(guān)，尤其對于特異性免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)具有重要作用。在B細(xì)胞表面，由CD19-CD21-CD81(TAPA-1)-CD225(Leu-13)共同構(gòu)成Ⅱ型補(bǔ)體受體復(fù)合物，該復(fù)合物與B細(xì)胞受體(BCR)共同參與B細(xì)胞活化的信號傳導(dǎo)。B細(xì)胞的激活需要BCR以及CD19-CD21-CD81-CD225復(fù)合物與抗原的雙重結(jié)合信號，其中，BCR與

4、抗原分子中的抗原決定簇結(jié)合，而CD19-CD21-CD81-CD225復(fù)合物則通過CD21與補(bǔ)體C3裂解片段C3d結(jié)合(抗原與C3d結(jié)合)。HCV E2蛋白與CD81分子的大胞外環(huán)結(jié)合，改變了B細(xì)胞激活的正常信號傳導(dǎo)通路，導(dǎo)致B細(xì)胞非特異性活化和免疫球蛋白基因的超突變。由于E2蛋白與CD81分子的結(jié)合，慢性HCV感染者體內(nèi)的B細(xì)胞大部分為活化的表型，在干擾素治療應(yīng)答者，隨著血清中HCV RNA水平的降低，外周血中激活的B細(xì)胞數(shù)量相應(yīng)顯著

5、減少。由于HCV慢性感染與B細(xì)胞淋巴瘤及冷球蛋白血癥的高度相關(guān)性，可以推測這與E2蛋白經(jīng)CD81分子異常激活B細(xì)胞可能有重要關(guān)系。HCV E2蛋白與人CD81分子的結(jié)合還能非特異性激活T淋巴細(xì)胞和下調(diào)T細(xì)胞表面的T細(xì)胞受體，這不利于HCV抗原特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)，并與慢性HCV感染所致肝組織內(nèi)大量非HCV抗原特異性T淋巴細(xì)胞浸潤造成的肝組織炎性損傷密切相關(guān)。此外，E2與人CD81分子的結(jié)合可抑制NK細(xì)胞的活化，抑制HCV感染后的立

6、早期非特異性抗病毒應(yīng)答。
　　 HCV E2蛋白結(jié)合人或者黑猩猩CD81分子可導(dǎo)致B淋巴細(xì)胞非特異性激活和免疫球蛋白基因的超突變以及異常免疫球蛋白的大量分泌，顯然，這可能與HCV自然感染只能極其有限地誘導(dǎo)中和抗體應(yīng)答以及天然結(jié)構(gòu)的E2蛋白免疫黑猩猩只能誘導(dǎo)低水平中和抗體應(yīng)答有重要關(guān)系。CD19-CD21-CD81-CD225復(fù)合物中，CD21與結(jié)合抗原的補(bǔ)體片段C3d結(jié)合，使CD19/CD21交聯(lián)，CD19胞漿區(qū)的酪氨酸殘基發(fā)生

7、磷酸化，起始胞內(nèi)的信號傳遞。CD81分子在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控CD19分子的表達(dá)和在胞膜的定位，CD81分子的交聯(lián)能引起B(yǎng)細(xì)胞的凝集。然而，HCV E2蛋白與CDB1分子結(jié)合對B細(xì)胞激活、增殖和分化的調(diào)控，以及導(dǎo)致特異性抗體應(yīng)答抑制的分子機(jī)制尚不清楚。闡明這些問題，有助于進(jìn)一步認(rèn)識和揭示HCV慢性感染以及HCV感染引發(fā)B細(xì)胞淋巴瘤以及自身免疫性疾病的本質(zhì)原因。
　　 HCV包膜E2蛋白與CD81分子結(jié)合可引起免疫細(xì)胞的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路

8、和細(xì)胞免疫功能的異常改變，本研究進(jìn)一步探討HCV E2蛋白經(jīng)CD81分子非特異性激活B細(xì)胞和抑制特異性免疫應(yīng)答的分子機(jī)制。HCV E2蛋白和HCVcc與Raji細(xì)胞表面CD81結(jié)合后觸發(fā)IκBα的磷酸化，上調(diào)抗凋亡Bcl-2家族蛋白，增強(qiáng)對Raji細(xì)胞在Fas介導(dǎo)的凋亡中的保護(hù)。此外，E2-CD81相互作用可上調(diào)CD81和共刺激分子CD80和CD86的表達(dá)，下調(diào)補(bǔ)體受體CD21。本研究有助于進(jìn)一步揭示HCV慢性感染以及HCV感染引發(fā)B細(xì)

9、胞淋巴增生紊亂以及延遲中和抗體出現(xiàn)的分子機(jī)制。
　　 1、CD81 RNA干擾和HCV E2質(zhì)粒的構(gòu)建及表達(dá)
　　 人CD81小干擾RNA(siRNA)表達(dá)質(zhì)粒pGCsi-U6-CD81 siRNA5作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得的siRNA表達(dá)體(siRNA expression cassette)被插入慢病毒載體pLenti6?；旌腺|(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，前者包括口炎病毒(VSV)糖蛋白表達(dá)質(zhì)粒，HIV gag/

10、pol(pLP1)質(zhì)粒，HIV rev(pLP2)質(zhì)粒和含有CD81 siRNA表達(dá)體的pLenti6載體。48小時后收集含有慢病毒顆粒的上清，用0.45μm孔徑的濾膜過濾。包含CD81siRNA表達(dá)體的慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)至Raji細(xì)胞，3天后再同法感染一次，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面表達(dá)的CD81。
　　 HCV1a型H77株截短型E2蛋白(aa364-661)DNA片段和突變的E2-W529/A(第529位色氨酸被置換成丙氨酸)分別插入

11、pCI-neo質(zhì)粒。上述兩種表達(dá)質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，72小時后去除上清收集細(xì)胞進(jìn)行裂解，裂解提取物中的重組蛋白用山羊抗E2多克隆抗體檢測。
　　 2、E2結(jié)合CHO和Raji細(xì)胞，E2包被和細(xì)胞刺激
　　 人CD81表達(dá)質(zhì)粒和模擬載體分別轉(zhuǎn)染至CHO細(xì)胞，48小時后流式細(xì)胞術(shù)檢測表達(dá)的CD81及E2蛋白與轉(zhuǎn)染后的CHO、Raji細(xì)胞的結(jié)合情況。
　　 E2單抗H53用碳酸鹽緩沖液稀釋至10μg/ml,加至

12、96孔板或24孔板，靜置于4℃過夜，用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，然后加入足量的RPMI1640完全培養(yǎng)基，37℃孵育30分鐘。轉(zhuǎn)染HCVE2表達(dá)質(zhì)?；蚰M載體的293T細(xì)胞提取物加至96或24孔板中，37℃孵育60分鐘。包被的多孔板進(jìn)一步用PBS沖洗，將培養(yǎng)于完全培養(yǎng)基中的Raji細(xì)胞混勻，加至多孔板，按實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行不同時間段的培養(yǎng)。
　　 3、HCV假病毒顆粒制備和感染
　　 293T細(xì)胞共轉(zhuǎn)染編碼HCV包膜糖蛋

13、白，gag/pol(pLP1)和rev(pLP2)的表達(dá)載體與編碼熒光素酶的轉(zhuǎn)移載體。48小時后收集含有HCVpp的上清，用0.45μm孔徑的濾膜過濾，以備下一步感染用。其中使用到HCV包膜蛋白表達(dá)質(zhì)粒有1a基因型H77株，1b基因型con-1株和2a基因型J6株。
　　 Huh7.5和Raji細(xì)胞作為靶細(xì)胞接種至96孔板，濃度為104個細(xì)胞/孔，37℃培養(yǎng)。每孔加入上述HCVpp上清50μl，培養(yǎng)5小時后棄上清，細(xì)胞用常規(guī)培養(yǎng)

14、基在37℃繼續(xù)培養(yǎng)72小時，棄上清，用PBS沖洗一次，每孔加50μl細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解，然后檢測熒光素酶活性。
　　 4、蛋白質(zhì)印跡法檢測
　　 將收集的細(xì)胞裂解物煮沸5分鐘，用濃度12.5％的含十二烷基磺酸鈉(SDS)的聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)進(jìn)行電泳分離蛋白。將蛋白電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，用不同的一抗、二抗分別處理后，再用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法檢測其免疫反應(yīng)性。
　　 二、干擾素α調(diào)節(jié)人肝癌細(xì)胞中MAPK和STAT1

15、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑
　　 干擾素(IFN)誘導(dǎo)的胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程和其抗病毒效應(yīng)有關(guān)，JAK-STAT通路在IFN誘導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起關(guān)鍵作用，IFN與細(xì)胞表面的特定受體結(jié)合后啟動該通路，IFN的抗病毒作用也主要由該通路調(diào)節(jié)。除了JAK-STAT通路外，其他一些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路也可能在對IFN的調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮重要作用。通過對干擾素α(IFN-α)刺激處理后的人肝癌細(xì)胞Huh7和HepG2中的MAPK和STAT1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)行檢測，我們發(fā)現(xiàn)I

16、FN-α可特異上調(diào)ERK的磷酸化水平，而對上游激酶MEK的磷酸化似乎無影響。我們同時還檢測到p38MAPK磷酸化輕度增加，SAPK/JNK的磷酸化顯著增強(qiáng)，下游的ATF-2磷酸化也增強(qiáng)了，這表明IFN-α對MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中各級聯(lián)反應(yīng)的信號分子有不同程度的上調(diào)作用。此外我們還發(fā)現(xiàn)IFN-α對STAT1的磷酸化有極大的增強(qiáng)作用，且IFN-α對MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)在Huh7和HepG2細(xì)胞中有所不同。
　　 小結(jié)：

17、　　 1.HCV E2蛋白和HCVcc都可引起IκBα的磷酸化，并上調(diào)抗凋亡的Bcl-2家族蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)Raji細(xì)胞對抗Fas-介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的能力。此外，這類刺激信號能上調(diào)CD81分子和其共刺激分子CD80和CD86，下調(diào)補(bǔ)體受體CD21。
　　 2.E2-CD81的結(jié)合是引發(fā)上述效應(yīng)的基礎(chǔ)，因?yàn)樵贑D81沉默的Raji細(xì)胞對E2和HCVcc都不產(chǎn)生反應(yīng)，且E2突變體E2-W529/A因其不能與CD81結(jié)合，對正常Raj

18、i細(xì)胞也產(chǎn)生不了刺激作用。
　　 3.E2-CD81結(jié)合可能是HCV感染導(dǎo)致B細(xì)胞淋巴增生紊亂和中和抗體水平低下的原因。
　　 4.IFN-α對MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中各級聯(lián)反應(yīng)的信號分子有不同程度的上調(diào)作用，對STAT1的磷酸化有極大的增強(qiáng)作用，并且對MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)在Huh7和HepG2細(xì)胞中有所不同
　　 5.本研究有助于進(jìn)一步揭示HCV慢性感染以及HCV感染引發(fā)B細(xì)胞淋巴增生紊亂以及延遲中和抗體出