HCC及血液系統(tǒng)惡性腫瘤中DNA甲基化腫瘤標志物研究.pdf

1、腫瘤標志物以無創(chuàng)性和簡便的優(yōu)點成為腫瘤早期診斷和病情監(jiān)測的重要指標。表觀遺傳學興起為從該角度推動腫瘤分子標志物發(fā)展提供了可能。DNA甲基化是表觀遺傳學三個組成部分之一，也是迄今為止研究最為成熟的一部分。DNA甲基化在腫瘤細胞中的具體表現(xiàn)為腫瘤細胞基因組整體的甲基化水平降低和特定基因5'端區(qū)域異常的甲基化改變兩類。以特定基因5'端CpG位點甲基化模式改變來早期診斷和描述腫瘤已有較多報道。 本課題首先把這一領域的先進理論和方法學進展

2、引進到研究具有我國地域特色的惡性腫瘤——原發(fā)性肝細胞癌(HCC)的研究中，試圖通過分析大多數(shù)腫瘤細胞表達而正常細胞不表達的腫瘤－精細胞系(CT)抗原家族的黑色素瘤抗原(MAGE)基因家族，把MAGE-A基因家族5'端CpG位點甲基化模式的改變作為HCC的新腫瘤標志物。在試驗中，用亞硫酸氫鹽修飾測序PCP(BSP)方法，直接把PCR產(chǎn)物測序，檢查HepG2、BEL7402、BEL7404和BEL7407四種HCC細胞株和外周血白細胞(WB

3、C)正常對照的甲基化模式的差異，尋找HCC特異的MAGE-A甲基化模式。根據(jù)HCC特異甲基化模式設計甲基化特異PCR(MSP)檢測引物，建立區(qū)分HCC和正常對照的MSP，檢測HCC和各種對照的病理切片和外周血漿游離DNA。 通過對肝癌細胞株的研究表明，在七個MAGE-A亞型中，MAGE-A1和MAGE-A3的5'端CpG位點甲基化模式表現(xiàn)出與正常對照明顯不同，由此設計的MSP檢測HCC病人和非HCC對照中，石蠟包埋病理切片標本和

4、外周血漿DNA，檢測HCC的靈敏度分別是91.2％和61.5％，而特異度均可達到100％。為使用DNA甲基化腫瘤標志物診斷HCC提供了直接的證據(jù)。 HCC中MAGE基因的異常甲基化研究，既直接證明了發(fā)展DNA甲基化腫瘤標志物的可能性，也建立了本實驗室研究DNA甲基化的方法學平臺。不過，隨著研究的深入，DNA甲基化腫瘤標志物研究中存在的一些問題也表現(xiàn)出來，突出體現(xiàn)在各文獻報道中，同樣的基因相似甲基化位點，在同樣類型腫瘤標本中，甲基

5、化檢測的陽性率不一致，差別很大。這一問題不能得到澄清，必將成為發(fā)展DNA甲基化腫瘤標志物的主要障礙。我們推測關鍵原因有兩點：(一)缺少對CpG位點全面甲基化狀態(tài)分析，以局部代表總體，導致檢測結果不一致；(二)缺乏大樣本驗證。對這兩個問題的求證使本研究的方向轉向了對血液系統(tǒng)惡性腫瘤這一亞型眾多的腫瘤的研究，構成了本研究的第二章節(jié)的內容。 本課題對正常對照WBC細胞和HL-60、K562、Jurkat及U937等四種不同類型的血液系

6、統(tǒng)疾病細胞株，用BSP方法，全長克隆測序P15、P73、O6MGMT、DAP-K、HIC1和CDH1等六個常見血液系統(tǒng)惡性腫瘤抑癌基因CpG島區(qū)域。根據(jù)各BSP產(chǎn)物的多個克隆測序結果，繪制各型細胞基因組六個基因詳細的甲基化狀態(tài)頻率圖譜。分析該圖譜，可見CpG位點區(qū)分為完全甲基化、完全去甲基化和部分甲基化三部分。顯示了各細胞基因組特定甲基化模式，找到一系列各型血液系統(tǒng)惡性腫瘤細胞株特異性甲基化改變位點。選擇出了可以作為區(qū)分這五種類型細胞的

7、特異性DNA甲基化位點組合，也即這五種不同基因組代表的正常和四種類型血液病的，潛在的特異性DNA甲基化CpG位點庫，作為進一步篩選DNA甲基化腫瘤標志物基礎。該部分的初步完成，顯示了特定基因DNA甲基化特異性改變診斷多種復雜腫瘤類型的能力，也顯示了各種腫瘤中各基因甲基化狀態(tài)的復雜性，提示了篩選DNA甲基化腫瘤標志物是一個需要反復篩查和驗證的大工程。同時，為下一步通過大量臨床標本驗證DNA甲基化模式作為腫瘤標志物的效能提供大量的候選CpG