ROCKⅡ、磷酸化MARCKS及nNOS在偏頭痛模型大鼠腦干及三叉神經(jīng)節(jié)中的表達(dá)變化.pdf

1、研究背景及目的: 偏頭痛是一種慢性、反復(fù)發(fā)作性的血管神經(jīng)性頭痛，主要表現(xiàn)為一側(cè)或雙側(cè)頭部搏動性疼痛、中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂，嚴(yán)重影響患者的工作和生活質(zhì)量。偏頭痛的病因及發(fā)病機(jī)制目前尚末完全明了，在眾多假說中腦干三叉神經(jīng)血管學(xué)說占有重要地位，腦干特別是三叉神經(jīng)脊束核尾部、C1、C2節(jié)段脊髓后角淺層及三叉神經(jīng)節(jié)在疼痛的傳遞過程中有重要作用。 Rho家族GTP酶是ras超家族的一員，Rho通過激活下游靶分子-Rho激酶調(diào)節(jié)細(xì)胞的

2、多種生物學(xué)行為和功能，Rho激酶屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族成員，以兩種同源性極高的異構(gòu)體形式存在(ROCKα/ROCK Ⅱ和ROCK β/ROCK Ⅰ)，其中ROCK α/ROCK Ⅱ主要在腦組織中表達(dá)。Kansu Buyukafsar等在大鼠傷害性刺激模型中發(fā)現(xiàn)脊髓及腦內(nèi)的Rho激酶蛋白水平明顯增高。Matsumura等在神經(jīng)痛大鼠模型中發(fā)現(xiàn)Rho激酶可以使富含十四酰丙氨酸的C激酶底物(Myristoylated alanine-

3、rich C-kinase substrate，MARCKS)159位點(diǎn)的絲氨酸磷酸化，進(jìn)而增加脊髓神經(jīng)型一氧化氮合酶(neural nitric oxide synthase，nNOS)的活性，導(dǎo)致一氧化氮(nitric oxide，NO)釋放增加，在疼痛的傳遞中起重要作用。Tatsumi等也發(fā)現(xiàn)Rho激酶通過磷酸化MARCKS而增加脊髓內(nèi)nNOS的活性，參與了炎癥及神經(jīng)痛的發(fā)病過程。 NO是目前公認(rèn)的在偏頭痛發(fā)病過程中起關(guān)鍵

4、作用的分子，它既可以擴(kuò)張血管產(chǎn)生頭痛，又可以做為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，參與疼痛的傳遞及中樞高敏感性的形成。目前認(rèn)為延遲性的頭痛與三叉神經(jīng)血管系統(tǒng)nNOS活性增加，催化生成的NO協(xié)同其它神經(jīng)遞質(zhì)將疼痛刺激向中樞傳遞有關(guān)，NOS抑制劑可部分抑制神經(jīng)源性硬腦膜血管擴(kuò)張及降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonim gene-related peptide，CGGR)的釋放而治療偏頭痛。 氟桂利嗪是一種新型的長效鈣離子拮抗劑，被公認(rèn)為是預(yù)防偏頭痛的一

5、線藥物。臨床雙盲對照研究表明，該藥可以有效減少偏頭痛發(fā)作的頻率及頭痛的嚴(yán)重程度，但氟桂利嗪預(yù)防偏頭痛發(fā)作的機(jī)制目前不明。 本研究將從ROCK Ⅱ、磷酸化MARCKS、nNOS著手，首先建立硝酸甘油型實(shí)驗(yàn)性偏頭痛大鼠模型，并同步設(shè)立生理鹽水對照組及藥物干預(yù)組，檢測腦干及三叉神經(jīng)節(jié)組織中上述各物質(zhì)mRNA及其蛋白的表達(dá)，并比較它們在發(fā)作期與間歇期的表達(dá)變化，以初步探討ROCK Ⅱ、磷酸化MARCKS、nNOS在偏頭痛發(fā)病機(jī)制中的作用

6、。 方法: 1.動物分組及處理：采用清潔級成年雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠為實(shí)驗(yàn)對象，隨機(jī)分為3組，模型組：依Tassorelli法皮下注射硝酸甘油10mg/kg，每周1次，共5周，制作實(shí)驗(yàn)性偏頭痛大鼠模型，并于第二次造模后給予生理鹽水10ml/kg/d灌胃，共4周；對照組：與模型組同步對照，以生理鹽水代替硝酸甘油皮下注射；干預(yù)組：自硝酸甘油第二次造模后，給予氟桂利嗪5mg/kg/d灌胃，共4周。

7、 2.受試動物于第5次造模后3小時(發(fā)作期)或第4天(間歇期)分別斷頭處死，取大鼠腦干及三叉神經(jīng)節(jié)組織，液氮內(nèi)保存。 3.RT-PCR法半定量檢測大鼠腦干及三叉神經(jīng)節(jié)組織ROCK Ⅱ、MARCKS、nNOS mRNA的表達(dá)。 4.Western-Blot法檢測大鼠腦干及三叉神經(jīng)節(jié)組織ROCK Ⅱ、磷酸化MARCKS、nNOS蛋白的表達(dá)。 結(jié)果: 1.在偏頭痛發(fā)作期，模型組及干預(yù)組大鼠腦干及三叉神經(jīng)節(jié)組織中

8、ROCK II mRNA及蛋白的表達(dá)均明顯高于間歇期和對照組(p<0.05)；而在偏頭痛間歇期，各組表達(dá)無明顯差異(p>0.05)。 2.與對照組相比，在偏頭痛發(fā)作期及間歇期，模型組和干預(yù)組大鼠的腦干及三叉神經(jīng)節(jié)組織中MARCKS mRNA的表達(dá)無變化(p>0.05)；pSl59-MARCKS蛋白的表達(dá)在間歇期亦無明顯變化(p>0.05)，而在發(fā)作期明顯上調(diào)(p<0.05)。 3.與對照組相比，在偏頭痛發(fā)作期及間歇期，模

9、型組及干預(yù)組大鼠腦干及三叉神經(jīng)節(jié)組織中nNOS mRNA的表達(dá)無變化(p>0.05)；而模型組nNOS蛋白的表達(dá)在發(fā)作期明顯上調(diào)(p<0.05)，干預(yù)組也稍有上調(diào)，但無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05)；在間歇期，模型組及干預(yù)組nNOS蛋白的表達(dá)均無明顯變化(p>0.05)。 結(jié)論: 1、ROCK II mRNA及蛋白、磷酸化MARCKS及nNOS蛋白表達(dá)的上調(diào)可能與偏頭痛的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。 2、氟桂利嗪預(yù)防偏頭痛發(fā)作的機(jī)