蛋白激酶A對(duì)膀胱移行細(xì)胞癌的生物學(xué)調(diào)控.pdf

1、膀胱癌是泌尿外科最常見(jiàn)的惡性腫瘤，通常采用經(jīng)尿道電切術(shù)或膀胱部分切除術(shù)進(jìn)行治療，具有較高的復(fù)發(fā)率，術(shù)后常規(guī)進(jìn)行膀胱灌注和膀胱鏡隨訪是膀胱癌治療過(guò)程中不可分割的一部分。目前，膀胱癌的發(fā)生機(jī)制尚 不明確。 真核細(xì)胞的分裂和增殖依賴(lài)于細(xì)胞周期的精確調(diào)控，腫瘤細(xì)胞參與調(diào)控細(xì)胞周期的基因發(fā)生突變，使細(xì)胞分裂失去正常的調(diào)控。生長(zhǎng)因子及其受體參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖，是研究最多的膀胱腫瘤標(biāo)記物，其中包括表皮生長(zhǎng)因子及其受體，胰島素樣生長(zhǎng)因子及

2、其受體，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及其受體，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子及其受體等。上述標(biāo)記物在膀胱移行細(xì)胞癌中高表達(dá)，參與調(diào)節(jié)腫瘤的新陳代謝和增殖，并與分期、分級(jí)和預(yù)后相關(guān)。 目前對(duì)于生長(zhǎng)因子及其受體的信號(hào)傳導(dǎo)通路的下游研究較少，而位于其下游的蛋白激酶對(duì)于信號(hào)的傳導(dǎo)起著至關(guān)重要的作用，是信號(hào)傳導(dǎo)鏈條中的軸心部分，通過(guò)蛋白激酶激活其它具有生物學(xué)活性的酶，發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞新陳代謝和增殖的作用。細(xì)胞因子及其受體對(duì)細(xì)胞新陳代謝和增殖的調(diào)節(jié)歸根結(jié)底要靠蛋白激酶的激活

3、來(lái)完成。因此，研究蛋白激酶對(duì)于了解生長(zhǎng)因子及其受體的作用機(jī)制具有重要意義。 目前認(rèn)為外界因素對(duì)細(xì)胞分裂主要有兩個(gè)調(diào)控點(diǎn)(restriction point)：一是處于G<,1>/S轉(zhuǎn)折點(diǎn)，控制細(xì)胞從靜止?fàn)顟B(tài)(G<,1>期)進(jìn)入DNA合成期(S期)；另一調(diào)控點(diǎn)處于G<,2>/M轉(zhuǎn)折點(diǎn)，是決定細(xì)胞一分為二的控制點(diǎn)。非增殖狀態(tài)的細(xì)胞處于G<,o>期，在某些刺激因素如生長(zhǎng)因子的誘導(dǎo)下，細(xì)胞由G<,o>期進(jìn)入S期。 PKA是第二信

4、使cAMP依賴(lài)的蛋白激酶，是細(xì)胞內(nèi)參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上重要的激酶，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化和增殖、離子轉(zhuǎn)運(yùn)、新陳代謝的調(diào)節(jié)、基因轉(zhuǎn)錄等過(guò)程。PKA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)是由受體、GTP結(jié)合蛋白(GTP bindingprotein和腺苷酸環(huán)化酶(AC)偶聯(lián)構(gòu)成。根據(jù)與C亞基結(jié)合的調(diào)節(jié)亞基的類(lèi)型分為APK全酶I型和II型。其中，I型與細(xì)胞惡變關(guān)系密切，參與許多生長(zhǎng)因子對(duì)細(xì)胞有絲分裂的調(diào)節(jié)過(guò)程。II型主要分布于正常組織，阻止有絲分裂信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制細(xì)胞的生

5、長(zhǎng)。很多學(xué)者認(rèn)為提高PKA活性能夠抑制細(xì)胞增殖，與cylinD表達(dá)下降相關(guān)，而抑制PKA活性能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，還與腫瘤的化療和放療的敏感性相關(guān)，但目前尚無(wú)PKA活性變化對(duì)膀胱癌細(xì)胞凋亡影響的報(bào)導(dǎo)。 本研究旨在揭示PICA RIa在膀胱移行細(xì)胞癌中的表達(dá)與腫瘤分期、分級(jí)和預(yù)后的關(guān)系；探討PKA活性變化對(duì)膀胱癌細(xì)胞株T24增殖的影響以及其中可能存在的相關(guān)機(jī)制。研究PKA活性變化對(duì)腫瘤增殖的影響，從細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路水平揭示膀胱腫瘤發(fā)

6、生和凋亡的機(jī)制，對(duì)將來(lái)治療膀胱腫瘤意義重大。 方法 1．組織部分：用Western blot方法檢測(cè)PICA RIa在膀胱癌移行細(xì)胞癌中的表達(dá)強(qiáng)度(定量)，并分析其與膀胱癌分期、分級(jí)和預(yù)后的關(guān)系。 2．細(xì)胞部分：分別用PKA信號(hào)傳導(dǎo)通路的激動(dòng)劑forskolin和抑制劑處理T24細(xì)胞后，用放免法檢測(cè)T24細(xì)胞中PKA活性的變化；用MTT法檢測(cè)T24細(xì)胞活力的變化；用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布的變化。用Weste

7、rnblot檢測(cè)forskolin．作用下T24細(xì)胞中cyclinD<,1>表達(dá)的變化及H-89作用下T24細(xì)胞中Bcl-2表達(dá)的變化。 結(jié)果 PKA RIa在腫瘤組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織，G<,2>和G<,3>級(jí)的表達(dá)強(qiáng)度顯著高于G<,1>,G<,2>和G<,3>之間未見(jiàn)顯著差異；在浸潤(rùn)型膀胱癌中的表達(dá)顯著高于淺表型膀胱癌。PICA RIa高表達(dá)組預(yù)后較低表達(dá)組差。forskohn能夠使T24細(xì)胞中的PKA活性增高

8、，并顯著降低細(xì)胞活力。在20umol/L forskohn作用24小時(shí)后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)可見(jiàn)T24細(xì)胞增殖受到抑制，細(xì)胞處于G<,1>期靜止?fàn)顟B(tài)。用20umol/L forskolin誘導(dǎo)T24細(xì)胞后，eyclinD<,l>表達(dá)呈下降趨勢(shì)。H-89能夠使T24細(xì)胞中的PKA活性下降，并顯著降低細(xì)胞活力。在30μmol/LH-89作用，36小時(shí)后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)可見(jiàn)T24細(xì)胞出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡。用15μmol/L H-89誘導(dǎo)。T24細(xì)胞

9、后，Bcl-2表達(dá)呈下降趨勢(shì)。 結(jié)論 1．PKA Riα表達(dá)強(qiáng)度與膀胱癌的分期、分級(jí)和預(yù)后關(guān)系密切，有可能作為膀胱癌的腫瘤標(biāo)記物。 2．Forskolin能夠顯著上調(diào)T24細(xì)胞中PKA的活性，PKA活性增高使T24細(xì)胞處于G<,1>期靜止，抑制其增殖，并顯著降低細(xì)胞活力。PKA活性增高所致的G<,1>期靜止可能與cyclinD<,1>的表達(dá)下降有關(guān)。 3．H-89能夠顯著下調(diào)T24細(xì)胞中PKA的活性，使T