EGFRvⅢ多肽致敏的DC-CTL對(duì)EGFRvⅢ+膠質(zhì)瘤細(xì)胞的體外殺傷作用.pdf

1、背景:隨著腫瘤學(xué)、免疫學(xué)的迅速發(fā)展，腫瘤的免疫治療以其副作用小、耐受性好越來(lái)越受到人們的重視，成為繼手術(shù)、放療、化療之后治療腫瘤的又一種方法。樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)是目前已知體內(nèi)抗原遞呈能力最強(qiáng)的APC，它可以通過(guò)多種途徑介導(dǎo)免疫反應(yīng)發(fā)揮抗腫瘤的作用，以DC為基礎(chǔ)的腫瘤免疫治療成為目前研究的重心。
　　表皮生長(zhǎng)因子受體Ⅲ型突變體(EGFRvⅢ)是表皮生長(zhǎng)因子(EGFR)最常見(jiàn)的突變體，在腦膠質(zhì)瘤、胃癌、乳腺癌等惡性腫瘤中高表達(dá)，與腫瘤

2、的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。EGFRvⅢ具有配體非依賴(lài)性激活下游信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)以及只在惡性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)的特性，成為腫瘤靶向治療良好的靶點(diǎn)。本研究體外制備DC，負(fù)載EGFRvⅢ多肽后，與T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)，刺激其增殖分化為細(xì)胞毒性的T淋巴細(xì)胞(cytotoxicTlymphocyte，CTL)，實(shí)現(xiàn)CTL特異性識(shí)別EGFRvⅢ陽(yáng)性的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞，體外驗(yàn)證其靶向性殺傷作用，探索膠質(zhì)瘤等惡性腫瘤免疫治療的新方法。
　　目的:檢測(cè)人外周血中

3、的單個(gè)核細(xì)胞體外培養(yǎng)分化為樹(shù)突狀細(xì)胞并負(fù)載EGFRvⅢ多肽后，誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞成為抗原特異性的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)的能力，并驗(yàn)證CTL對(duì)EGFRvⅢ+U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞的特異性殺傷作用。
　　方法:抽取健康志愿者的外周血，利用Ficoll淋巴細(xì)胞分離液、密度梯度離心法分離出單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，加入細(xì)胞因子IL-4、GM-CSF誘導(dǎo)其分化為不成熟的DC。在培養(yǎng)基中加入EGFRvⅢ多肽，不成熟的DC攝取抗原后發(fā)育為成熟的DC，

4、流式細(xì)胞儀測(cè)定其表型變化。從外周血獲得T淋巴細(xì)胞，加入細(xì)胞因子IL-2刺激其增殖，并與成熟的DC混合培養(yǎng)，使T淋巴細(xì)胞不斷增殖、活化為CTL。將EGFRvⅢ+U87細(xì)胞、U87細(xì)胞這2種膠質(zhì)瘤細(xì)胞作為靶細(xì)胞加入96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)24小時(shí)，然后按效靶比20∶1加入2種效應(yīng)細(xì)胞，即用EGFRvⅢ活化的CTL和單加IL-2培養(yǎng)的T淋巴細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置3個(gè)對(duì)照組，細(xì)胞毒試驗(yàn)組和對(duì)照組均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)12h后加入MTT，再繼續(xù)培養(yǎng)4h，酶標(biāo)儀測(cè)

5、每孔的OD值，測(cè)量波長(zhǎng)490nm，計(jì)算殺傷率。
　　結(jié)果:從外周血分離獲得的單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)3h后，倒置顯微鏡下觀察，大多數(shù)細(xì)胞呈圓形、成簇排列，貼壁生長(zhǎng)。取少量細(xì)胞計(jì)數(shù)，健康人1ml靜脈血可獲得1.4×106個(gè)單核細(xì)胞，吸出懸浮細(xì)胞，并加入含10％FBS、50ng/mlIL-4、500ng/mlrhGM-CSF的RPMI1640培養(yǎng)液。培養(yǎng)24h后，貼壁細(xì)胞減少，懸浮細(xì)胞增多，倒置顯微鏡下觀察可見(jiàn)部分細(xì)胞聚集成團(tuán);培養(yǎng)48h后，細(xì)

6、胞的形態(tài)開(kāi)始變得不規(guī)則，懸浮細(xì)胞逐漸增多;3d時(shí)細(xì)胞表面伸出許多短小的毛刺樣突起，體積增大，簇狀生長(zhǎng)，呈小集落樣;至5、6d時(shí)DC表面的毛刺樣突起較前增長(zhǎng)、增粗，體積增大，懸浮細(xì)胞增多;培養(yǎng)至7d，細(xì)胞體積增大，形態(tài)各異，大小不等，有的粗短，有的細(xì)長(zhǎng)，大部分呈懸浮生長(zhǎng)，分布比較均勻，出現(xiàn)典型的樹(shù)突狀突起。DC的表型檢測(cè)結(jié)果顯示，DC的成熟性標(biāo)志CD83的表達(dá)率僅為2.36％，DC的MHC-Ⅱ類(lèi)分子HLA-DR的表達(dá)率為54.38％，CD

7、80的表達(dá)率為9.27％，可見(jiàn)此時(shí)的DC處于未成熟狀態(tài)。負(fù)載EGFRvⅢ多肽后再檢測(cè)DC的表型，結(jié)果表明DC高表達(dá)CD83、HLA-DR及共刺激分子CD80，可見(jiàn)未成熟的DC經(jīng)EGFRvⅢ多肽沖擊后分化為成熟的DC。成熟的DC與T淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)后，刺激T淋巴細(xì)胞不斷增殖，可使CD3+CD8+T細(xì)胞比率由5.4％提高到12.7％。負(fù)載EGFRvⅢ多肽的DC誘導(dǎo)的CTL對(duì)EGFRvⅢ+U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞的殺傷率(45.21±4.53)％明顯

8、高于單加IL-2培養(yǎng)的T細(xì)胞的殺傷率(12.30±2.15)％，差異較顯著有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);負(fù)載EGFRvⅢ多肽的DC誘導(dǎo)的CTL對(duì)U87細(xì)胞的殺傷率為(14.48±3.50)％，與單加IL-2培養(yǎng)的T細(xì)胞的殺傷率(18.10±4.16)％相比差異不顯著(P＞0.05)。
　　結(jié)論:負(fù)載EGFRvⅢ多肽的DC誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)，具有特異性識(shí)別和殺傷EGFRvⅢ+U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞的功能，為膠質(zhì)瘤的免疫治療