PDGF及其受體在慢性胰腺炎胰腺纖維化機(jī)制中的作用及其對(duì)策的研究.pdf

1、第一部分 目的：建立慢性胰腺炎大鼠模型。 方法：wister大鼠84只，隨機(jī)分為模型組、對(duì)照組。各組大鼠均暴露膽胰管，以微動(dòng)脈夾夾閉其近肝門(mén)處，以41/2針頭穿刺膽胰管。模型組用微量輸液泵40分鐘內(nèi)輸注含2％三硝基苯磺酸(TNBS)的10％乙醇PBS溶液0.4m1。對(duì)照組輸注等量等濃度的乙醇PBS溶液。兩組分別于術(shù)后第1、2、3、4、5、6、7周各時(shí)間點(diǎn)取胰腺組織，每次每組各6只大鼠。胰腺組織標(biāo)本切片，行HE染色、Mas

2、son膠原染色，光鏡觀察。應(yīng)用電鏡觀察胰腺組織超微結(jié)構(gòu)的變化。參照試劑盒說(shuō)明測(cè)定血清淀粉酶、C肽、透明質(zhì)酸含量。應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)I型膠原在胰腺組織中的表達(dá)。 結(jié)果： 1．光鏡下：對(duì)照組胰腺組織未見(jiàn)明顯纖維化。模型組第1、2周胰腺組織可見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，未見(jiàn)有明顯纖維化。第3周可見(jiàn)胰管擴(kuò)張，胰腺小葉周?chē)伴g質(zhì)內(nèi)纖維組織輕度增生。Masson膠原染色可見(jiàn)胰腺間質(zhì)及部分小葉內(nèi)有藍(lán)色膠原纖維沉積。第4周時(shí)，胰管增生明顯，胰

3、管周及胰腺小葉間、小葉內(nèi)纖維組織增生明顯，并有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，局部可見(jiàn)胰腺腺體萎縮，腺體萎縮部位有纖維組織代替，胰腺內(nèi)分泌組織未見(jiàn)有明顯纖維化。Masson膠原染色可見(jiàn)胰腺間質(zhì)及小葉內(nèi)可見(jiàn)大量的藍(lán)色膠原纖維。術(shù)后第5、6、7周胰腺組織病理改變與第4周相似，無(wú)明顯改變。2．電鏡下：對(duì)照組可見(jiàn)胰腺腺胞、胰管上皮細(xì)胞線粒體腫脹，間質(zhì)內(nèi)纖維無(wú)明顯增多。模型組第1、2周胰腺間質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)少量活化的胰腺星狀細(xì)胞(PSC)，其內(nèi)維生素A脂滴消失，胰腺腺胞

4、線粒體腫脹、有多種囊泡形成。第3周，胰腺組織間質(zhì)內(nèi)活化的PSC以及成纖維細(xì)胞明顯增多，間質(zhì)內(nèi)纖維增多，腺胞內(nèi)線粒體明顯腫脹、透明。第4周時(shí)，胰腺組織間質(zhì)內(nèi)活化的PSC、成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞明顯增多，間質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)大量的纖維成分。胰腺腺胞內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯擴(kuò)張，腺胞體積減少。第5、6、7周胰腺組織變化基本同第4周。 3．胰腺組織Ⅰ型膠原的表達(dá)：對(duì)照組在胰腺間質(zhì)有少量表達(dá)，模型組第2周可見(jiàn)胰腺間質(zhì)內(nèi)有少量著色，第3周胰腺間質(zhì)內(nèi)有明顯表達(dá)，

5、第4～7周胰腺間質(zhì)內(nèi)表達(dá)明顯增加。 4．胰腺組織膠原染色圖像分析：模型組胰腺組織內(nèi)膠原面積百分比：各時(shí)間點(diǎn)分別為6.50±3.64％、8.55±4.19％、19.23±5.20％，37.29±6.74％，35.85±6.15％，34.50±6.44％，33.49±5.68％。第1、2周與對(duì)照組無(wú)明顯差異，第3、4、5、6、7周分別明顯強(qiáng)于對(duì)照組，第3周與其后各時(shí)間點(diǎn)比較差異明顯(均/P<0.01)，第4、5、6、7周比較差

6、異無(wú)顯著性(均P>0.05)。 5．血清淀粉酶在模型組的測(cè)定值均較對(duì)照組升高(均P<0.01)。血清透明質(zhì)酸、C肽在第3～7周均明顯高于對(duì)照組(均P<0.01)。 結(jié)論： 1．膽胰管內(nèi)注射2％TNBS乙醇PBS溶液的方法成功復(fù)制慢性胰腺炎的動(dòng)物模型。 2．本方法可反映急性胰腺炎向慢性胰腺炎轉(zhuǎn)化的動(dòng)態(tài)過(guò)程，符合人類(lèi)慢性胰腺炎病情演變的規(guī)律。 3．本方法造模4周，既可滿足研究需要。第二部分 P

7、DGF及其受體在慢性胰腺炎胰腺纖維化機(jī)制中的作用 目的：探討血小板源生長(zhǎng)因子(PDGF)及其受體(PDGFR)在胰腺纖維化過(guò)程中的作用及意義。 方法：wister大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組。采用膽胰管內(nèi)注射含2％TNBS的10％乙醇PBS溶液0.4ml的方法制備慢性胰腺炎大鼠動(dòng)物模型。應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)PDGF-A、PDGF-B、PDGFR-α、PDGFR-β及α一平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)在術(shù)后第1、2、3、4

8、、5、6、7周胰腺組織中的表達(dá)；應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(RT-PCR)檢測(cè)模型組不同時(shí)期PDGFmRNA、PDGFR mRNA的表達(dá)。 結(jié)果： 1．免疫組化染色：對(duì)照組PDGF、PDGFR在腺泡細(xì)胞、胰腺間質(zhì)內(nèi)低表達(dá)，PDGFR-α僅在術(shù)后第1周表達(dá)；α-SMA少量表達(dá)于血管壁。模型組中，PDGF-A、PDGF-B主要在胰腺間質(zhì)、纖維化區(qū)、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)區(qū)表達(dá)；PDGF-A在造模后第1周表達(dá)明顯上調(diào)，在第2～7周表達(dá)

9、逐漸下調(diào)；PDGF-B在造模后第1～4周表達(dá)逐漸上調(diào)，在第5～7周表達(dá)下調(diào)；PDGFR-α在造模后第1、2周主要在胰腺間質(zhì)、纖維間隔中表達(dá)，其余時(shí)間點(diǎn)胰腺組織中未見(jiàn)表達(dá)；PDGFR-β主要在胰腺間質(zhì)、纖維間隔、纖維化區(qū)表達(dá)，在造模后第l～4周表達(dá)逐漸上調(diào)，在第5～7周表達(dá)下調(diào)。PDGF-B、PDGFR-β的表達(dá)分別明顯強(qiáng)于同時(shí)期PDGF-A、PDGFR-α(均P<0.01)；第4周α-SMA主要表達(dá)在胰腺間質(zhì)、纖維化區(qū)等部位；PDGF-

10、B、PDGFR-β、α-SMA在模型組中表達(dá)較對(duì)照組明顯增強(qiáng)(均P<0.01)；PDGF-A在第1、2周的表達(dá)強(qiáng)于對(duì)照組(均P<0.05)：PDGFR-α在第1、2周的表達(dá)強(qiáng)于對(duì)照組(均P

11、R-α的表達(dá)無(wú)相關(guān)(均P>0.05)。2．PDGF mRNA、PDGFR mRNA在模型組中的表達(dá)：PDGF-A mRNA、PDGFR-α mRNA表達(dá)呈逐漸下調(diào)趨勢(shì)；PDGF-B mRNA表達(dá)呈先逐漸上調(diào)，于第3、4周達(dá)高峰，第5-7周表達(dá)逐漸下調(diào)；PDGFR-β mRNA表達(dá)呈先逐漸上調(diào)，于第4周達(dá)高峰，第5-7周表達(dá)逐漸下調(diào)。 結(jié)論： 1．PDGF、PDGFR可促進(jìn)慢性胰腺炎發(fā)生纖維化過(guò)程。其中PDGF-B及

12、PDGFR-β作用尤為突出。 2．PDGF、PDGFR促慢性胰腺炎胰腺纖維化的作用主要發(fā)生在病程的早、中期。 第三部分 己酮可可堿對(duì)大鼠慢性胰腺炎胰腺纖維化干預(yù)的研究 目的：觀察己酮可可堿(PTX)對(duì)大鼠慢性胰腺炎胰腺纖維化的影響。 方法：Wister大鼠18只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、PTX干預(yù)組。采用膽胰管內(nèi)注射含2％TNBS的10％乙醇PBS溶液0.4m1的方法制備慢性胰腺炎大鼠動(dòng)物模型。術(shù)后第

13、2天PTX干預(yù)組大鼠開(kāi)始腹腔注射PTX，劑量為6mg/Kg.d，模型組腹腔注射等量生理鹽水。三組大鼠均于術(shù)后第4周處死取胰腺。采用免疫組化技術(shù)檢測(cè)α-SMA、PDGF、磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1、2(P-ERK<,1>、P-ERK<,2>)、Ⅰ型膠原(COLⅠ)在胰腺組織中表達(dá)同時(shí)做組織膠原染色。部分胰腺組織液氮凍存，應(yīng)用免疫印跡(Western blot)方法檢測(cè)α-SMA、P-ERK<,1>、P-ERK<,2>在胰腺組織中的表達(dá)。

14、 結(jié)果：術(shù)后第4周，模型組發(fā)生胰腺纖維化，PTX干預(yù)組有輕度纖維化。免疫組化染色顯示：PTX干預(yù)組α-SMA、PDGF、P-ERK<,1>、P-ERK<,2>、COLⅠ的表達(dá)均低于模型組(均P<0.05)。膠原染色顯示：PTX干預(yù)組膠原面積百分比明顯低于模型組(P<0.01)。Western blot結(jié)果顯示α-SMA、P-ERK<,1>、P-ERK<,2>在PTX干預(yù)組中的蛋白表達(dá)明顯低于模型組。 結(jié)論： 1